當(dāng)在完整狀態(tài)下進(jìn)行分析時(shí)，EPO的聚糖異質(zhì)性導(dǎo)致了非常復(fù)雜的質(zhì)譜圖。通過在 37°C 下在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小時(shí)，可以有效地去除 N 糖（含有PNGase F酶）和 O-糖，如對(duì)應(yīng)于未修飾蛋白質(zhì)的單個(gè)峰所示。EPO上殘留了少量用乙?；僖核嵝揎椀腛-聚糖，因?yàn)镺mniGLYZOR對(duì)這種結(jié)構(gòu)的水解效率低下。根據(jù)制造商Genvois的建議（在37°C下進(jìn)行O/N孵育），兩種底物蛋白也用另一種市售的去糖基化產(chǎn)物處理，并顯示數(shù)據(jù)以供比較。另一方面，N-聚糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯地連接到未折疊的蛋白質(zhì)上。這導(dǎo)致某些 N-糖基化位點(diǎn)難以被 Genovis的PNGase F 接近，或者一旦底物蛋白折疊成其天然狀態(tài)，就根本無法接近。因此，這種N-聚糖的水解需要底物蛋白以與酶活性相容的方式變性。實(shí)現(xiàn) O-糖譜分析、位點(diǎn)占用測定和 O-糖肽圖譜以及使用 LC-MS 分析的中級(jí)方法。甘肅固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

糖蛋白性能測試：O-聚糖的巖藻糖基化參與功能上重要的聚糖表位的合成，例如血型抗原和劉易斯結(jié)構(gòu)。分析用這種復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)修飾的糖蛋白可能具有挑戰(zhàn)性，需要高效和特異性的酶工具。我們在許多糖基工程TNFR蛋白上測試了Genovis的FucosEXO，這些蛋白攜帶多達(dá)11個(gè)O-聚糖，這些O-聚糖以不同的鍵裝飾。我們將該活性與其他市售巖藻苷酶進(jìn)行了比較。FucosEXO 能夠在 1 小時(shí)內(nèi)對(duì)所有三種 TNFR 蛋白進(jìn)行去巖藻糖磺酸處理，而用其他巖藻糖酶處理導(dǎo)致部分去除巖藻糖或根本沒有去除。四川用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶GalactEXO 是一種β-半乳糖苷酶混合物，可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-連接末端半乳糖。

為了研究 OglyZOR 對(duì)天然糖蛋白的活性，將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時(shí)。當(dāng)唾液酸被去除時(shí)，OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品，以鑒定其他PTM或確認(rèn)氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化：O-糖基化生物制藥（如依那西普）很難表征。為了能夠通過質(zhì)譜法測定完整質(zhì)量數(shù)，我們進(jìn)行了酶促總?cè)ヌ腔?。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解，而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。

Genovis的PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）是一種糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺與所有哺乳動(dòng)物天冬酰胺連接復(fù)合物、雜交或高甘露糖寡糖的內(nèi)層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。該酶用于MS分析前的樣品制備，以降低蛋白質(zhì)異質(zhì)性并實(shí)現(xiàn)游離的聚糖分析，并研究N-聚糖的功能作用。1. 對(duì)所有哺乳動(dòng)物N-聚糖的高效水解；2.對(duì)多種糖蛋白具有活性；3.可固定在即用型離心柱產(chǎn)品形式；4. 自動(dòng)化友好型，96孔板，用于高通量 N-糖去除。Genovis的ImpaRATOR 是一種 O-糖依賴性蛋白酶，可消化攜帶粘蛋白型。O-聚糖的蛋白質(zhì)，包括唾液酸化物質(zhì)、糖基化絲氨酸和 Thr 殘基的 N-末端。該酶產(chǎn)生攜帶 O-糖的糖肽，從而實(shí)現(xiàn) O-糖譜分析、位點(diǎn)占用測定和 O-糖肽圖譜以及使用 LC-MS 分析的中級(jí)方法。1. 特異性廣 - 接受多種 O-聚糖變體，包括唾液酸化物種；2. 可靠O-聚糖特異性蛋白酶 – 消化絲氨酸/蘇氨酸糖基化位點(diǎn)的 N 末端；3. 穩(wěn)健的消化，增強(qiáng)復(fù)雜生物制藥的表征。而不會(huì)用酶污染z終制劑，可用于水解 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白。

我們測量了FucosEXO從一組dai表不同鍵的不同寡糖底物中釋放的巖藻糖。FucosEXO可有效釋放α1-2、α1-3和α1-4連接的巖藻糖，對(duì)α1-6連接的巖藻糖殘基沒有活Genovis的FucosEXO的底物特異性：巖藻糖以不同的鍵存在于N-和O-聚糖上。α1-2、α1-3 和 α1-4 連接的巖藻糖常見于 O-聚糖中，并作為 N-聚糖的天線巖藻糖基化，而 α1-6 連接的巖藻糖被發(fā)現(xiàn)是 N-聚糖he心的修飾。β1-3,4半乳糖的水解：Genovis的GalactEXO 是一種β-半乳糖苷酶混合物，可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-連接末端半乳糖。上海倍篤生物涵蓋藥物研發(fā)的全流程，抗體結(jié)構(gòu)域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶等。四川凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

使用 GalNAcEXO 對(duì) O-糖基化生物制藥進(jìn)行 Tn 抗原表征。甘肅固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

GalNAcEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)的GalNAcEXO酶，用于水解糖蛋白上的GalNAc殘基，而不會(huì)用酶污染制劑。Microspin 色譜柱可用于水解 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白。1. 易于使用的離心柱；2. 提高酶與底物的比例，提高消化效率；3. 終樣品中不含酶。用于水解離心柱中糖蛋白上的Genovis的GalNAc殘基的固定化酶。GalNAcEXO 酶是一種n 外α-N-乙酰半乳糖氨酸酶，可快速有效地水解來自天然 O-糖蛋白的 z es GalNAc 殘基。 該酶來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為52 kDa。 該酶在 Tn 抗原和 α1-3 連接末端 GalNAcs 上均顯示活性。在這里，我們展示了如何使用GalNAcEXO來表征復(fù)雜的生物制藥。甘肅固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究