冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之樣品制備：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的制備既要能夠保持本身的結(jié)構(gòu)又能抗脫水、電子輻射?，F(xiàn)在普遍采用的方法是通過快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態(tài)，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內(nèi)。冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)(即無定形態(tài))的冰，需要冷凍速率達(dá)到每秒鐘104攝氏度。此時(shí)，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會(huì)因成像角度不同而導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。該方法有兩個(gè)步驟:一是將樣品在載網(wǎng)上形成一薄層水膜:二是將第步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數(shù)情況下，用手工將載網(wǎng)迅速浸入液氮內(nèi)可使水冷凍成為玻璃態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)在于將樣品保持在接近生活狀態(tài)，不會(huì)因脫水而變形，同時(shí)可以減少輻射損傷。冷凍電鏡“分辨率改變”使其成為獲得優(yōu)于3?結(jié)構(gòu)的常規(guī)技術(shù)。黃山低溫電子顯微鏡技術(shù)方案

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)一般流程為：蛋白表達(dá)純化；負(fù)染樣品準(zhǔn)備：約2小時(shí)完成；負(fù)染樣品的數(shù)據(jù)收集：約8小時(shí)完成；冷凍樣品的準(zhǔn)備：約4小時(shí)完成；冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集：48-120小時(shí)完成。三維結(jié)構(gòu)重建。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機(jī)物質(zhì)，這些會(huì)降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結(jié)構(gòu)。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應(yīng)在1mg/ml左右，膜蛋白應(yīng)保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達(dá)標(biāo)，做一個(gè)樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰，均一性大于90%。南京低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)原理冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢：更接近天然狀態(tài)，不需要蛋白質(zhì)結(jié)晶。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過專門的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對高能電子的輻射敏感，照相時(shí)必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過程，較終在記錄介質(zhì)上會(huì)形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像。利用計(jì)算機(jī)對這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來，一個(gè)技術(shù)上的重大突破是高分辨率圖像采集設(shè)備的開發(fā)與應(yīng)用?；诨パa(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)技術(shù)開發(fā)的直接探測電子成像的裝置使電子顯微放大圖像的信噪比相對過去所使用的底片或電荷耦合元件(CCD)有了很大提高、進(jìn)而提高了成像的質(zhì)量。

冷凍電鏡技術(shù)也正在成為助力醫(yī)藥研發(fā)的有力手段。依托對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解，科學(xué)家正在開發(fā)更有效的治Ca藥、打菌素、止痛藥、麻醉劑等。中國過去10多年里，建成了世界上較大的冷凍電鏡設(shè)施。中國的科學(xué)家，也在冷凍電鏡領(lǐng)域取得了很多舉世矚目的成就，引起了世界的普遍關(guān)注。比如清華大學(xué)的施一公團(tuán)隊(duì)，對老年癡呆癥相關(guān)的重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，對于我們理解它的發(fā)病機(jī)理甚至開發(fā)重要治療方法有重要意義。他們對剪接體復(fù)合體一系列結(jié)構(gòu)的研究幫助我們理解細(xì)胞的演化、細(xì)胞的基因調(diào)控和其他一些相關(guān)疾病有著重要意義。2019年，中國科學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)解析到世界上目前分辨率較高的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)，這對我們了解該病毒的發(fā)病機(jī)理，以及如何更好開發(fā)疫苗具有重要意義。冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢：適合于研究結(jié)構(gòu)不規(guī)則的大分子復(fù)合物，對于分子量的上限沒有限制。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis)；(6)對重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結(jié)合生物化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。冷凍電子顯微技術(shù)主要包括單顆粒冷凍電鏡技術(shù)和冷凍電子斷層掃描技術(shù)。蕪湖冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)哪里有

冷凍電鏡技術(shù)的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。黃山低溫電子顯微鏡技術(shù)方案

冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用情況：近年來，冷凍電鏡技術(shù)在全球范圍被大眾所熟知，并且被越來越多的學(xué)術(shù)界和跨國制藥企業(yè)所采用。在藥物研發(fā)方面，多個(gè)跨國公司已經(jīng)將冷凍電鏡技術(shù)用于藥物發(fā)現(xiàn)。雖然冷凍電鏡技術(shù)屬于前沿技術(shù)，但目前已經(jīng)有利用冷凍電鏡基于結(jié)構(gòu)研發(fā)的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。冷凍電鏡技術(shù)在藥品開發(fā)過程中的應(yīng)用實(shí)例，進(jìn)一步說明該技術(shù)在藥品（生物制品）的質(zhì)量方面有前瞻性的意義。在回顧技術(shù)應(yīng)用的同時(shí)，也看到了未來冷凍電鏡技術(shù)在新藥研發(fā)方面的幾個(gè)前瞻方向。我們相信冷凍電鏡在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)、生物制劑高級結(jié)構(gòu)表征、冷鏈運(yùn)輸過程中的質(zhì)量控制中將發(fā)揮越來越重要的作用。黃山低溫電子顯微鏡技術(shù)方案

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