冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡：冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備，將樣品冷卻到液氮溫度(77K)，用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實(shí)的樣品形貌。它的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先是加速電壓高，電子能穿透厚樣品;第二是透鏡多，光學(xué)性能好;第三是樣品臺穩(wěn)定;第四是全自動(dòng)，自動(dòng)換液氮，自動(dòng)換樣品，自動(dòng)維持清潔。冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法理論成像分辨率更高。廣州冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)一般流程為：蛋白表達(dá)純化；負(fù)染樣品準(zhǔn)備：約2小時(shí)完成；負(fù)染樣品的數(shù)據(jù)收集：約8小時(shí)完成；冷凍樣品的準(zhǔn)備：約4小時(shí)完成；冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集：48-120小時(shí)完成。三維結(jié)構(gòu)重建。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機(jī)物質(zhì)，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結(jié)構(gòu)。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應(yīng)在1mg/ml左右，膜蛋白應(yīng)保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達(dá)標(biāo)，做一個(gè)樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰，均一性大于90%。武漢透射電鏡技術(shù)服務(wù)中心冷凍電鏡技術(shù)的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜。

冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用情況：近年來，冷凍電鏡技術(shù)在全球范圍被大眾所熟知，并且被越來越多的學(xué)術(shù)界和跨國制藥企業(yè)所采用。在藥物研發(fā)方面，多個(gè)跨國公司已經(jīng)將冷凍電鏡技術(shù)用于藥物發(fā)現(xiàn)。雖然冷凍電鏡技術(shù)屬于前沿技術(shù)，但目前已經(jīng)有利用冷凍電鏡基于結(jié)構(gòu)研發(fā)的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。冷凍電鏡技術(shù)在藥品開發(fā)過程中的應(yīng)用實(shí)例，進(jìn)一步說明該技術(shù)在藥品（生物制品）的質(zhì)量方面有前瞻性的意義。在回顧技術(shù)應(yīng)用的同時(shí)，也看到了未來冷凍電鏡技術(shù)在新藥研發(fā)方面的幾個(gè)前瞻方向。我們相信冷凍電鏡在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)、生物制劑高級結(jié)構(gòu)表征、冷鏈運(yùn)輸過程中的質(zhì)量控制中將發(fā)揮越來越重要的作用。

冷凍電鏡技術(shù)也正在成為助力醫(yī)藥研發(fā)的有力手段。依托對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解，科學(xué)家正在開發(fā)更有效的治Ca藥、打菌素、止痛藥、麻醉劑等。中國過去10多年里，建成了世界上較大的冷凍電鏡設(shè)施。中國的科學(xué)家，也在冷凍電鏡領(lǐng)域取得了很多舉世矚目的成就，引起了世界的普遍關(guān)注。比如清華大學(xué)的施一公團(tuán)隊(duì)，對老年癡呆癥相關(guān)的重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，對于我們理解它的發(fā)病機(jī)理甚至開發(fā)重要治療方法有重要意義。他們對剪接體復(fù)合體一系列結(jié)構(gòu)的研究幫助我們理解細(xì)胞的演化、細(xì)胞的基因調(diào)控和其他一些相關(guān)疾病有著重要意義。2019年，中國科學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)解析到世界上目前分辨率較高的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)，這對我們了解該病毒的發(fā)病機(jī)理，以及如何更好開發(fā)疫苗具有重要意義。冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像：低劑量輻照成像，普通樣品材料在進(jìn)行表征時(shí)，電子劑量越高成像質(zhì)量越好。

冷凍電鏡技術(shù)測定結(jié)構(gòu)的幾種方法：X射線晶體學(xué)、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，將這幾種方法結(jié)合共同研究結(jié)構(gòu)與功能將使結(jié)構(gòu)生物學(xué)家對所研究的分子有更為全部的理解，而這些信息是單用任何一個(gè)方法所無法獲得的。將X射線晶體模型與經(jīng)電鏡獲得的密度圖重合可以對電鏡三維重構(gòu)的結(jié)構(gòu)作更詳盡的解釋，例如將牛的水通道（AQP1,與人的有90%同源性）的高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)與先前用冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出來的人的中等分辨率水通道的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，可以進(jìn)一步確定冷凍電鏡獲得的中等分辨率的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也顯示出了冷凍電鏡技術(shù)的優(yōu)勢和局限性。另一方面，較低分辨率的電鏡三維重構(gòu)模型可以用來解釋病毒或大分子的晶體結(jié)構(gòu)。而且，將X射線晶體的精細(xì)結(jié)構(gòu)與冷凍電鏡的重構(gòu)模型結(jié)合構(gòu)建生物大分子復(fù)合物在發(fā)揮功生物學(xué)功能過程中出現(xiàn)的構(gòu)像變化模型。這很大程度增加了我們對于復(fù)雜分子的活動(dòng)機(jī)制的理解。電子顯微技術(shù)，成像技術(shù)，計(jì)算機(jī)技術(shù)，生物信息技術(shù)等不同學(xué)科的結(jié)合，將為我們提供研究生命現(xiàn)象與本質(zhì)的強(qiáng)有力的手段。冷凍電子顯微鏡技術(shù)還將普遍應(yīng)用于細(xì)胞組織的超微結(jié)構(gòu)解析，對解開生命活動(dòng)的規(guī)律和機(jī)制等產(chǎn)生更大影響。湖州低溫冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)方案

冷凍電子顯微鏡技術(shù)具有研究對象普遍、樣品需求量少、更接近生理狀態(tài)等獨(dú)特優(yōu)勢。廣州冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：首先是樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個(gè)特制的樣品載網(wǎng)上面。載網(wǎng)由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網(wǎng)迅速投入到液態(tài)乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質(zhì)分散固定在玻璃態(tài)的冰膜中。然后電鏡圖像采集。選擇較有可能產(chǎn)生較佳圖像的較佳顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品。廣州冷凍電鏡技術(shù)服務(wù)