CUT&RUN和ChIC是兩種用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的技術(shù)，它們有一些關(guān)鍵的區(qū)別：1.**技術(shù)原理**：-**ChIC（ChromatinImmunocleavage）**：ChIC技術(shù)利用抗體將感興趣的蛋白與ProteinA-MNase相結(jié)合來進(jìn)行DNA切割。ChIC的優(yōu)勢(shì)在于使用TF特異性抗體系住MNase，并只在結(jié)合位點(diǎn)裂解。-**CUT&RUN（CleavageUnderTargetsandReleaseUsingNuclease）**：CUT&RUN技術(shù)則是在核的輕微MNase處理后釋放單核小體和TF-DNA復(fù)合物，留下寡核小體。CUT&RUN通過在冰上進(jìn)行簡(jiǎn)短的消化反應(yīng)，在TF結(jié)合的MNase擴(kuò)散到周邊的基因組和裂解可接近的染色質(zhì)之前在上清中恢復(fù)TF-DNA復(fù)合物。2.**操作步驟和簡(jiǎn)便性**：-**ChIC**：ChIC可能需要甲醛固定操作，這可能重新引入了ChIP-seq的一些問題，如交聯(lián)導(dǎo)致的DNA和蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。-**CUT&RUN**：CUT&RUN簡(jiǎn)化了操作步驟，使用磁珠固定細(xì)胞核，適用于新鮮和冷凍組織樣本，縮短了生成DNA測(cè)序文庫(kù)的時(shí)間（1-2天）。3.**背景信號(hào)和信噪比**：-**ChIC**：ChIC產(chǎn)生的背景信號(hào)可能較高，因?yàn)樗赡苌婕暗椒翘禺愋缘腄NA切割。

為了確保PCR實(shí)驗(yàn)中BstDNAPolymeraseI的活性比較大化，以下是一些關(guān)鍵的優(yōu)化措施：1.**反應(yīng)緩沖液**：使用適合BstDNAPolymeraseI的反應(yīng)緩沖液，如NEB提供的IsothermalAmplificationBufferIIPack，該緩沖液包含Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween®20，pH值為8.8，專為等溫?cái)U(kuò)增設(shè)計(jì)。2.**反應(yīng)條件**：BstDNAPolymeraseI的比較好反應(yīng)溫度通常在65°C左右。確保PCR儀能夠精確控制并保持這一溫度，以保證酶的活性和穩(wěn)定性。3.**酶的濃度**：根據(jù)反應(yīng)體系的需要調(diào)整BstDNAPolymeraseI的用量。過多的酶可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，而過少則可能降低擴(kuò)增效率。通常，一個(gè)單位的酶能夠在65°C下，30分鐘內(nèi)將25nmol的dNTP摻入酸不溶性物質(zhì)。4.**Mg2+濃度**：Mg2+是DNA聚合酶活性的關(guān)鍵輔因子。其濃度對(duì)PCR反應(yīng)有影響，需要根據(jù)具體情況調(diào)整Mg2+濃度，以獲得比較好的擴(kuò)增效果。5.**dNTPs濃度**：dNTPs是DNA合成的基礎(chǔ)原料，其濃度約為200-300μM較為適宜。過高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。6.**引物設(shè)計(jì)**：設(shè)計(jì)特異性引物，通常長(zhǎng)度為18-30個(gè)堿基，Tm（熔解溫度）相近，以保證同時(shí)退火。7.**模板DNA的質(zhì)量和純度**：確保模板DNA無蛋白質(zhì)、RNA和其他雜質(zhì)的污染，這些雜質(zhì)可能會(huì)抑制酶的活性。Bombesin泛素連接酶E3識(shí)別特定的靶蛋白，并促進(jìn)E2上的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，形成靶蛋白-泛素復(fù)合物。

T7EndonucleaseI(T7EI)在CRISPR/Cas9基因編輯中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在突變體檢測(cè)和基因編輯效率評(píng)估上。以下是T7EI在CRISPR/Cas9中的具體應(yīng)用步驟和特點(diǎn)：1.**基因編輯效率評(píng)估**：-T7EI用于評(píng)估CRISPR-Cas9在給定的導(dǎo)向RNA靶位點(diǎn)上對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行基因編輯的效率。-通過PCR擴(kuò)增圍繞CRISPR導(dǎo)向RNA靶位點(diǎn)的基因組DNA，如果CRISPR-Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)事件引入了突變，變性和退火將形成突變型和野生型PCR擴(kuò)增子的異源雙鏈DNA。2.**突變體檢測(cè)**：-如果CRISPR/Cas9編輯成功在DNA上引入突變，則可與野生型DNA片段退火產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA。T7EI可以識(shí)別該DNA上的不完全配對(duì)的DNA位點(diǎn)然后進(jìn)行雙鏈切割，通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶，從而半定量判定基因編輯效果。-T7EI能識(shí)別長(zhǎng)度大于或等于2bp的插入、缺失或突變導(dǎo)致的錯(cuò)配DNA，不能識(shí)別1bp的插入、缺失或突變。3.**實(shí)驗(yàn)步驟**：-收集細(xì)胞并提取基因組DNA，然后使用PCR擴(kuò)增期望編輯的基因組區(qū)域。擴(kuò)增子的長(zhǎng)度建議為0.5-1kb。-對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行變性和退火復(fù)性，以產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA。-使用T7EI酶處理退火后的DNA產(chǎn)物，在37℃孵育15分鐘。

在PCR實(shí)驗(yàn)中，為了避免引物與已知序列的交叉反應(yīng)，從而確保實(shí)驗(yàn)的特異性，以下是一些關(guān)鍵的引物設(shè)計(jì)原則和策略：1.**選擇高保守性區(qū)域**：引物比較好設(shè)計(jì)在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)，這樣可以確保引物與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合。通過比較不同物種的同一基因序列，可以確定基因的保守區(qū)。2.**避免引物與非目標(biāo)序列的同源性**：設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)避免與基因組中的重復(fù)序列、假基因或高同源性區(qū)域設(shè)計(jì)引物?？梢酝ㄟ^BLAST等工具對(duì)引物進(jìn)行同源性分析，確保引物只與目標(biāo)序列結(jié)合。3.**引物長(zhǎng)度和GC含量**：引物長(zhǎng)度一般在15-30堿基之間，常用的是18-27bp。GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜。過高或過低的GC含量都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC含量和Tm值應(yīng)保持接近。4.**避免引物的3'端錯(cuò)配**：引物3'端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，特別是倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物3'端比較好不要選擇A，比較好選擇T，因?yàn)楫?dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率降低。5.**避免引物自身及引物之間的互補(bǔ)序列**：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。前后引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體的形成。泛素連接酶E3識(shí)別特定的靶蛋白，并促進(jìn)E2上的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，形成泛素化標(biāo)記。

Lambda核酸外切酶（λExonuclease）在PCR產(chǎn)物的克隆中主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面：1.**單鏈DNA的生成**：-Lambda核酸外切酶可以用于從雙鏈DNA中生成單鏈DNA。由于該酶沿5'→3'方向逐步切去5'單核苷酸，底物是5'磷酸化的雙鏈DNA，因此可以用來消化PCR產(chǎn)物中的一條鏈，從而生成單鏈DNA，這對(duì)于某些克隆技術(shù)來說是必要的步驟。2.**PCR產(chǎn)物的克隆**：-在克隆過程中，有時(shí)需要將PCR產(chǎn)物的5'端磷酸化，以便與載體連接。Lambda核酸外切酶可以消化非磷酸化的DNA，從而在一定程度上幫助準(zhǔn)備適合克隆的PCR產(chǎn)物。3.**減少自身環(huán)化和非特異性連接**：-在連接反應(yīng)中，為了減少質(zhì)粒載體的自身環(huán)化，可以使用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNA以去除5'磷酸基團(tuán)。而Lambda核酸外切酶可以消化5'端磷酸化的DNA，因此在某些情況下，它可以輔助減少PCR產(chǎn)物的自身環(huán)化，尤其是在PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)中。4.**提高克隆效率**：-通過消化PCR產(chǎn)物中的一條鏈，Lambda核酸外切酶可以幫助減少PCR產(chǎn)物的非特異性連接，從而提高克隆的效率和準(zhǔn)確性。綜上所述，Lambda核酸外切酶在PCR產(chǎn)物的克隆中主要通過生成單鏈DNA、準(zhǔn)備適合克隆的PCR產(chǎn)物、減少自身環(huán)化和非特異性連接以及提高克隆效率等方面發(fā)揮作用。去泛素化酶可以去除泛素化標(biāo)記，這一步驟是泛素化過程的逆轉(zhuǎn)過程，它允許細(xì)胞對(duì)泛素化事件進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。rTEV Protease重組煙草蝕紋病毒蛋白酶

E1在ATP的存在下激發(fā)泛素分子，通過一個(gè)硫酯鍵將泛素的C末端甘氨酸殘基與E1酶的活性連接起來。rTEV Protease重組煙草蝕紋病毒蛋白酶

嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶I（BstDNAPolymeraseI）和它的大片段（LargeFragment）是兩種在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的酶。它們的主要區(qū)別在于結(jié)構(gòu)和活性：1.**結(jié)構(gòu)**：-完整的BstDNAPolymeraseI包含一個(gè)5'→3'的核酸外切酶活性區(qū)域，而大片段是通過基因工程改造或蛋白酶處理去掉了這個(gè)外切酶活性區(qū)域的酶。因此，大片段沒有5'→3'的核酸外切酶活性，但保留了5'→3'的DNA聚合酶活性。2.**活性**：-BstDNAPolymeraseI具有5'→3'的核酸外切酶活性，這意味著它在合成DNA的同時(shí)可以“校對(duì)”錯(cuò)誤，切除不匹配的核苷酸。而大片段由于缺少外切酶活性區(qū)域，不具有這種校對(duì)能力。-大片段具有更強(qiáng)的鏈置換能力，這使得它非常適合于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，如環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）。3.**應(yīng)用**：-BstDNAPolymeraseI由于具有校對(duì)功能，可能更適合于需要高保真度的DNA合成反應(yīng)。-BstDNAPolymerase,LargeFragment由于其鏈置換能力，更適合于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這些技術(shù)不需要熱循環(huán)儀，可以在恒定溫度下進(jìn)行DNA擴(kuò)增。4.**熱穩(wěn)定性**：-BstDNAPolymerase,LargeFragment通常在65°C左右的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，而BstDNAPolymeraseI可能具有更寬的反應(yīng)溫度范圍。rTEV Protease重組煙草蝕紋病毒蛋白酶