EndoS糖苷內(nèi)切酶S在抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)上。通過(guò)上海藥物所的研究，開(kāi)發(fā)了一種新穎的糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略，利用EndoS2這種糖苷內(nèi)切酶，可以將小分子細(xì)胞毒藥物“一步”定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了糖鏈定點(diǎn)ADC化合物的制備。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)相比傳統(tǒng)的隨機(jī)偶聯(lián)具有更好的方法指數(shù)，能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性，是當(dāng)前ADC領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域N297位，這是一個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，通過(guò)在該位點(diǎn)引入細(xì)胞物質(zhì)，可以形成具有優(yōu)勢(shì)的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（glycosite-specificADCs,gsADCs）。此外，EndoS2對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性，能夠高效獲得功能修飾的糖工程抗體，并且可以用于抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究。研究人員通過(guò)這種“一步”制備策略得到的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物，在結(jié)構(gòu)均一性、親水性、體外穩(wěn)定性以及體外活性方面表現(xiàn)良好，并且在體內(nèi)瘤抑制活性方面，相比陽(yáng)性對(duì)照ADC化合物，在低載藥量的情況下具有更強(qiáng)的抑制效果。EndoS酶的這些應(yīng)用，不僅展示了其在簡(jiǎn)化ADC制備流程中的潛力，還有助于推動(dòng)定點(diǎn)ADC藥物的深入發(fā)展，為未來(lái)的生物藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路和方法。泛素連接酶E3識(shí)別特定的靶蛋白，并促進(jìn)E2上的泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，形成泛素化標(biāo)記。大腸桿菌DNA連接酶

在DNA提取過(guò)程中避免RNA污染的關(guān)鍵在于采取一系列措施來(lái)確保RNA被有效去除或降解，同時(shí)保護(hù)DNA的完整性和純度。以下是一些確保DNA提取過(guò)程中避免RNA污染的策略：1.**使用專門的DNA提取試劑盒**：選擇高質(zhì)量的DNA提取試劑盒，這些試劑盒通常已經(jīng)包含了防止RNA污染的措施，如特定的裂解液和純化步驟，能夠有效去除RNA。2.**加入RNA酶（RNase）處理**：在DNA提取過(guò)程中加入RNase處理步驟，可以有效地去除殘留的RNA污染。RNase是一種能夠特異性降解RNA的酶，可以在不影響DNA完整性的前提下去除RNA污染。3.**優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作步驟**：在破碎細(xì)胞時(shí)，選擇合適的破碎方法和破碎時(shí)間，避免過(guò)度破碎導(dǎo)致RNA的釋放；在DNA純化階段，控制好離心速度和時(shí)間，避免RNA的沉淀。4.**使用無(wú)RNase的試劑和耗材**：使用經(jīng)過(guò)RNase-free處理的實(shí)驗(yàn)器材和試劑，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不會(huì)引入外源性RNA污染。5.**嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境**：保持實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面和工作區(qū)域干凈無(wú)塵，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消殺，避免RNA酶污染。6.**個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范**：在處理DNA樣品時(shí)，佩戴無(wú)菌手套和口罩，以減少呼吸道和皮膚污染的風(fēng)險(xiǎn)。使用不同的工具處理不同的樣品，或者在處理前后徹底清洗工具，避免交叉污染。大腸桿菌DNA連接酶泛素化蛋白隨后被靶向到26S蛋白酶體進(jìn)行降解，或出現(xiàn)蛋白位置或活性變化。

磁珠法DNA凝膠回收試劑盒是一種用于從DNA瓊脂糖凝膠中回收特定DNA片段的實(shí)驗(yàn)室工具。與傳統(tǒng)的柱純化方法相比，磁珠法具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)：1.**操作簡(jiǎn)便快捷**：磁珠法DNA凝膠回收試劑盒的操作步驟通常包括凝膠的融化、DNA的結(jié)合、磁珠的洗滌和DNA的洗脫，整個(gè)過(guò)程可以在20分鐘內(nèi)完成。2.**高純度和高回收率**：磁珠法能夠穩(wěn)定、高效地從凝膠中回收DNA，純化所得的DNA可直接用于酶切、連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、測(cè)序、PCR、雜交等后續(xù)操作。通?；厥章蔬_(dá)到60-80%，對(duì)于200bp以下小片段和10kb以上大片段的回收率有所下降。3.**適用性廣**：適用于100bp以上DNA片段的純化，對(duì)達(dá)到10kb片段DNA的純化也能保持較好的效果。4.**安全性高**：操作過(guò)程中不涉及酚/氯仿等有毒試劑，更加環(huán)保和安全。5.**靈活性**：可以根據(jù)實(shí)際狀況靈活調(diào)節(jié)磁珠用量，適應(yīng)不同體積和濃度的樣品處理。6.**自動(dòng)化和高通量**：磁珠法純化試劑盒適合手工操作，也可用于自動(dòng)化工作站或核酸自動(dòng)提取儀，實(shí)現(xiàn)高通量操作。

EndoS糖苷內(nèi)切酶在ADCs制備中的具體應(yīng)用步驟，根據(jù)上海藥物研究所的研究，可以概括為以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：1.**篩選糖底物和糖苷內(nèi)切酶**：研究人員篩選了一系列糖底物和糖苷內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)Endo-S2酶能夠?qū)⒍堑孜風(fēng)acNAc轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)，且LacNAc半乳糖6號(hào)位唾液酸化修飾不影響Endo-S2的轉(zhuǎn)糖基化活性。2.**抗體糖基化改造**：利用Endo-S2和LacNAc的組合，直接實(shí)現(xiàn)野生型抗體的糖基化改造。Endo-S2對(duì)多樣化LacNAc修飾的兼容性，可以高效獲得功能修飾的糖工程抗體。3.**設(shè)計(jì)合成藥物-連接子復(fù)合物**：研究人員設(shè)計(jì)并合成了LacNAc-linker-drug復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)ADC化合物“一步”組裝的關(guān)鍵。4.**“一步”定點(diǎn)偶聯(lián)**：通過(guò)Endo-S2的催化作用，將小分子細(xì)胞毒藥物通過(guò)特定的糖鏈結(jié)構(gòu)直接定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn)，簡(jiǎn)化了ADCs的制備流程。5.**評(píng)價(jià)和測(cè)試**：對(duì)獲得的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)均一性、親水性、體外穩(wěn)定性及體外活性的測(cè)試。測(cè)試結(jié)果顯示，這些化合物具有非常好的結(jié)構(gòu)均一性（DAR=2）、親水性和體外穩(wěn)定性，并且在體外具有強(qiáng)大的瘤抑制活性。

EndoH糖苷內(nèi)切酶H在實(shí)驗(yàn)中的特異性和效率通常通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)確定：1.**特異性識(shí)別**：EndoH能夠特異性地識(shí)別并切割高甘露糖型N-連接糖鏈，這些糖鏈通常存在于未成熟的糖蛋白中。2.**切割位點(diǎn)**：EndoH識(shí)別并切割殼二糖結(jié)構(gòu)中的β-1,4-糖苷鍵連接的甘露糖型結(jié)構(gòu)糖鏈，但不能切割復(fù)雜型糖鏈糖蛋白。3.**酶活性測(cè)試**：通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白底物進(jìn)行酶活性測(cè)試，可以確定EndoH的活性和效率。4.**純化效果**：EndoH的純度可大于95%，這有助于確保實(shí)驗(yàn)中酶的高效性。5.**比較分析**：與其他去糖基化酶（如PNGaseF）進(jìn)行比較分析，可以評(píng)估EndoH的特異性和效率。6.**應(yīng)用效果**：EndoH用于基于DNA測(cè)序的熒光輔助糖電泳(DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonucleaseB,RNaseB)的糖基結(jié)構(gòu)，可以比較不同酶的糖基切割功能。7.**酶切時(shí)間**：EndoH的酶切時(shí)間通常為1-3小時(shí)，這有助于評(píng)估酶的效率。8.**產(chǎn)品信息**：通過(guò)查看產(chǎn)品信息，包括產(chǎn)品編號(hào)、規(guī)格和目錄價(jià)，可以了解EndoH的商業(yè)可用性和應(yīng)用范圍。通過(guò)這些方法，研究人員可以確保EndoH在糖鏈分析中的特異性和效率，從而獲得準(zhǔn)確的糖鏈結(jié)構(gòu)信息。One Step RT-qPCR SYBR Green Kit 是一種用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒，它結(jié)合了反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟。Somatostatin 28 (1-14)

E1在ATP的存在下激發(fā)泛素分子，通過(guò)一個(gè)硫酯鍵將泛素的C末端甘氨酸殘基與E1酶的活性連接起來(lái)。大腸桿菌DNA連接酶

EndoH糖苷內(nèi)切酶H（EndoH）在實(shí)驗(yàn)中通常用于分析以下類型的糖鏈：1.**高甘露糖型糖鏈**：EndoH能夠特異性地識(shí)別并切割高甘露糖型N-連接糖鏈，這些糖鏈通常存在于未成熟的糖蛋白中。2.**某些雜合型糖鏈**：EndoH也能對(duì)某些雜合型寡聚糖的殼二糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割，去除糖蛋白中的N-連接高甘露糖。3.**N-連接糖鏈**：EndoH主要用于去除糖蛋白中的N-連接高甘露糖，這有助于研究糖鏈結(jié)構(gòu)和糖基化模式。4.**抗體糖型分析**：在IgG中，F(xiàn)c區(qū)Asn297處的保守N-連接糖對(duì)其活性至關(guān)重要，EndoH可用于分析這些糖鏈。5.**糖蛋白的糖基化模式**：EndoH有助于分析糖蛋白的糖基化位點(diǎn)、糖基化程度以及糖鏈的具體結(jié)構(gòu)。6.**糖鏈分析和結(jié)構(gòu)表征**：在糖鏈分析的主要策略中，EndoH作為高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的去糖基化方法，有助于從糖蛋白上游離糖鏈，然后進(jìn)行詳細(xì)的分析表征。EndoH的使用可以為研究者提供關(guān)于糖蛋白糖基化模式的重要信息，尤其是在抗體藥物研究和開(kāi)發(fā)中，對(duì)于理解糖鏈如何影響藥物的活性、穩(wěn)定性和免疫原性具有重要意義。