可見光激發(fā)Ca2+熒光探針:與紫外光激發(fā)探針相比,可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能,對Ca2+變化水平檢測敏感度也更高,能夠降低對活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾,且無光譜偏移。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3,F(xiàn)luo-4,Rhod-2等,同時他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一,是典型的的單波長指示劑,比較大激發(fā)波長為506nm,比較大發(fā)射波長為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光,結(jié)合后熒光會增加60至100倍,從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實(shí)際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右,發(fā)射波長為525~530nm(圖3)。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個升級版本Fluo-4,在相同Ca2+濃度下信號更強(qiáng)。鈣成像技術(shù)的不斷進(jìn)步,使得人們對神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域有了進(jìn)一步的拓展。西安熒光顯微鈣成像動物行為學(xué)
鈣離子在很多生理活動中都發(fā)揮著重要作用,除了在肌肉細(xì)胞收縮中扮演著重要的角色,鈣離子也是神經(jīng)元活動的重要“風(fēng)向標(biāo)”之一:當(dāng)神經(jīng)元膜電位發(fā)生去極化,產(chǎn)生的動作電位傳導(dǎo)到神經(jīng)元軸突末梢時,細(xì)胞膜上的電壓門控鈣離子通道打開,大量鈣離子內(nèi)流,包含神經(jīng)遞質(zhì)的囊泡由突觸前膜釋放至后膜,下游神經(jīng)元就得以接受到上游的信號。因此,鈣離子成像可以追蹤神經(jīng)元動作電位,從而幫助我們了解神經(jīng)元集群的活動,可以用于感知覺,學(xué)習(xí)記憶,社會性行為等各種各樣的研究中。深圳動物神經(jīng)元鈣成像nVista3.0超微顯微鈣成像顯微鏡是研究活動動物神經(jīng)活動必要儀器。
鈣成像技術(shù)(calciumimaging)是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面,在在體(invivo)或者離體(invitro)實(shí)驗(yàn)中,鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于同時監(jiān)測成百上千個神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,從而檢測神經(jīng)元的活動情況)。有了鈣成像技術(shù),原本悄無聲息的神經(jīng)活動就變成了一幅斑斕閃爍的壯觀影像,科學(xué)家終于可以親眼看著神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中往來穿梭。因此,這種技術(shù)一出現(xiàn),就受到了全世界神經(jīng)科學(xué)家們的追捧,至今依然是人們觀測神經(jīng)活動直接的手段。
鈣離子通過參與多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)控絕大多數(shù)類型神經(jīng)元的功能。由于鈣離子信號在已知的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其特定的功能,鈣離子成像顯得尤為重要。在神經(jīng)系統(tǒng)中,由于神經(jīng)元的多樣性,導(dǎo)致鈣離子功能也多樣化。在突觸前膜,鈣內(nèi)流激發(fā)貯存神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)小泡向胞外釋放;在突觸后膜,樹突棘內(nèi)鈣水平瞬間升高,介導(dǎo)了突觸可塑性;在細(xì)胞核內(nèi),鈣信號能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄?,F(xiàn)在常使用的鈣離子指示劑有化學(xué)性鈣離子指示劑(ChemicalIndicators)和基因編碼鈣離子指示劑(GeneticallyEncodedIndicators)兩類。我們的鈣成像系統(tǒng)集成自動控制和精確計時的多模式輸入端口。
紫外光激發(fā)Ca2+熒光探針Fura-2和Indo-1都是紫外光激發(fā)的雙波長Ca2+熒光指示劑,也是目前較常用的比率型鈣離子熒光探針。與其他代的熒光指示劑相比,它們的熒光信號更強(qiáng),對Ca2+的選擇性也更強(qiáng)。比率指示劑會在與Ca2+結(jié)合后會改變吸收/發(fā)射特性。以雙波長激發(fā)指示劑Fura-2為例。如圖2所示,低Ca2+濃度下,F(xiàn)ura-2在~380nm處激發(fā),高Ca2+濃度下,在~340nm處激發(fā)。光譜由兩個峰組成:左側(cè)較短波長的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而增大,右側(cè)較長波長的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而減小。通過340/380nm交替激發(fā),獲取在510nm處對應(yīng)的發(fā)射光熒光強(qiáng)度的比率,就可以對Ca2+濃度進(jìn)行定量的測量。因?yàn)镕ura-2結(jié)果準(zhǔn)確,且不易被漂白,所以得到了普遍使用。鈣成像系統(tǒng)集成自動控制和精確計時的多模式輸入端口。深圳動物神經(jīng)元鈣成像nVista3.0
傳統(tǒng)的鈣成像技術(shù)受限于顯微鏡的視野,只能對很小的一片區(qū)域進(jìn)行記錄。西安熒光顯微鈣成像動物行為學(xué)
與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深層成像等功能,這兩個優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整在體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年,JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像,這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題,但這會帶來其他問題,例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。西安熒光顯微鈣成像動物行為學(xué)