可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能，對(duì)Ca2+變化水平檢測(cè)敏感度也更高，能夠降低對(duì)活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無(wú)光譜偏移。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時(shí)他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長(zhǎng)指示劑，比較大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無(wú)熒光，結(jié)合后熒光會(huì)增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個(gè)升級(jí)版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號(hào)更強(qiáng)。鈣成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，使得人們對(duì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域有了進(jìn)一步的拓展。西安熒光顯微鈣成像動(dòng)物行為學(xué)
鈣離子在很多生理活動(dòng)中都發(fā)揮著重要作用，除了在肌肉細(xì)胞收縮中扮演著重要的角色，鈣離子也是神經(jīng)元活動(dòng)的重要“風(fēng)向標(biāo)”之一：當(dāng)神經(jīng)元膜電位發(fā)生去極化，產(chǎn)生的動(dòng)作電位傳導(dǎo)到神經(jīng)元軸突末梢時(shí)，細(xì)胞膜上的電壓門控鈣離子通道打開，大量鈣離子內(nèi)流，包含神經(jīng)遞質(zhì)的囊泡由突觸前膜釋放至后膜，下游神經(jīng)元就得以接受到上游的信號(hào)。因此，鈣離子成像可以追蹤神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?，從而幫助我們了解神?jīng)元集群的活動(dòng)，可以用于感知覺，學(xué)習(xí)記憶，社會(huì)性行為等各種各樣的研究中。深圳動(dòng)物神經(jīng)元鈣成像nVista3.0超微顯微鈣成像顯微鏡是研究活動(dòng)動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)必要儀器。
鈣成像技術(shù)（calciumimaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測(cè)組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面，在在體（invivo）或者離體（invitro）實(shí)驗(yàn)中，鈣成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用于同時(shí)監(jiān)測(cè)成百上千個(gè)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而檢測(cè)神經(jīng)元的活動(dòng)情況）。有了鈣成像技術(shù)，原本悄無(wú)聲息的神經(jīng)活動(dòng)就變成了一幅斑斕閃爍的壯觀影像，科學(xué)家終于可以親眼看著神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中往來(lái)穿梭。因此，這種技術(shù)一出現(xiàn)，就受到了全世界神經(jīng)科學(xué)家們的追捧，至今依然是人們觀測(cè)神經(jīng)活動(dòng)直接的手段。
鈣離子通過(guò)參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控絕大多數(shù)類型神經(jīng)元的功能。由于鈣離子信號(hào)在已知的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其特定的功能，鈣離子成像顯得尤為重要。在神經(jīng)系統(tǒng)中，由于神經(jīng)元的多樣性，導(dǎo)致鈣離子功能也多樣化。在突觸前膜，鈣內(nèi)流激發(fā)貯存神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)小泡向胞外釋放；在突觸后膜，樹突棘內(nèi)鈣水平瞬間升高，介導(dǎo)了突觸可塑性；在細(xì)胞核內(nèi)，鈣信號(hào)能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在常使用的鈣離子指示劑有化學(xué)性鈣離子指示劑（ChemicalIndicators）和基因編碼鈣離子指示劑（GeneticallyEncodedIndicators）兩類。我們的鈣成像系統(tǒng)集成自動(dòng)控制和精確計(jì)時(shí)的多模式輸入端口。
紫外光激發(fā)Ca2+熒光探針Fura-2和Indo-1都是紫外光激發(fā)的雙波長(zhǎng)Ca2+熒光指示劑，也是目前較常用的比率型鈣離子熒光探針。與其他代的熒光指示劑相比，它們的熒光信號(hào)更強(qiáng)，對(duì)Ca2+的選擇性也更強(qiáng)。比率指示劑會(huì)在與Ca2+結(jié)合后會(huì)改變吸收/發(fā)射特性。以雙波長(zhǎng)激發(fā)指示劑Fura-2為例。如圖2所示，低Ca2+濃度下，F(xiàn)ura-2在~380nm處激發(fā)，高Ca2+濃度下，在~340nm處激發(fā)。光譜由兩個(gè)峰組成：左側(cè)較短波長(zhǎng)的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而增大，右側(cè)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而減小。通過(guò)340/380nm交替激發(fā)，獲取在510nm處對(duì)應(yīng)的發(fā)射光熒光強(qiáng)度的比率，就可以對(duì)Ca2+濃度進(jìn)行定量的測(cè)量。因?yàn)镕ura-2結(jié)果準(zhǔn)確，且不易被漂白，所以得到了普遍使用。鈣成像系統(tǒng)集成自動(dòng)控制和精確計(jì)時(shí)的多模式輸入端口。深圳動(dòng)物神經(jīng)元鈣成像nVista3.0
傳統(tǒng)的鈣成像技術(shù)受限于顯微鏡的視野，只能對(duì)很小的一片區(qū)域進(jìn)行記錄。西安熒光顯微鈣成像動(dòng)物行為學(xué)
與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整在體大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái)，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問題，但這會(huì)帶來(lái)其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。西安熒光顯微鈣成像動(dòng)物行為學(xué)
