膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)立取代了電壓鉗技術(shù),是細(xì)胞電生理研究的一個(gè)飛躍,使得離子通道的研究,從宏觀深入到微觀,使昔日的“肉湯生理學(xué)(brothphysiology)”與“閃電生理學(xué)(lightningphysiology)”在分子水平上結(jié)合起來,使人們對(duì)膜通道的認(rèn)識(shí)耳目一新。當(dāng)前,生理學(xué)、生物物理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等多種學(xué)科正在把膜片鉗技術(shù)和膜通道蛋白重組技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)和光譜技術(shù)等非電生理技術(shù)結(jié)合起來,協(xié)同對(duì)離子通道進(jìn)行較全的研究。不少實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將基因工程與膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來,把通道蛋白有目的地重組于人工膜中進(jìn)行研究。設(shè)想將合成的通道蛋白分子接種入機(jī)體以替換有缺陷和異常的通道的功能而達(dá)到的目的。小片膜的孤立使對(duì)單個(gè)離子通道進(jìn)行研究成為可能。全細(xì)胞膜片鉗高阻抗封接
對(duì)單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究,將膜片鉗技術(shù)與單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)欠磻?yīng)技術(shù)結(jié)合,在全細(xì)胞膜片鉗記錄下,將單細(xì)胞內(nèi)容物或整個(gè)細(xì)胞(包括細(xì)胞膜)吸入電極中,將細(xì)胞內(nèi)存在的各種mRNA全部快速逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增及待檢的特異mRNA的檢測(cè),借此可對(duì)形態(tài)相似而電活動(dòng)不同的結(jié)果做出分子水平的解釋或?yàn)閱渭?xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供標(biāo)本,為同一結(jié)構(gòu)中形態(tài)非常相似但功能不同的事實(shí)提供分子水平的解釋。目前國(guó)際上掌握此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室較少,我國(guó)北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所于1994年在國(guó)內(nèi)率先開展。日本單電極膜片鉗細(xì)胞功能特性早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術(shù)作細(xì)胞內(nèi)電活動(dòng)的記錄。
膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合Neher等**將膜片鉗技術(shù)與Fura2熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合,同時(shí)進(jìn)行如細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞膜離子通道電流及細(xì)胞膜電容等多指標(biāo)變化的快速交替測(cè)定,這樣便可得出同一事件過程中,多種因素各自的變化情況,進(jìn)而可分析這些變化間的相互關(guān)系。Neher將可光解出鈣離子的鈣螯合物引入膜片鉗技術(shù),進(jìn)而可以定量研究鈣離子濃度與分泌率的關(guān)系及比較大分泌率等指標(biāo)。他又創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測(cè)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)聯(lián)合運(yùn)用的技術(shù)。之后又將光電聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)首先結(jié)合起來。這種結(jié)合既能研究分泌機(jī)制,又能鑒別分泌物質(zhì),還能互相彌補(bǔ)各單種方法的不足。Eberwine等于1991年首先將膜片鉗技術(shù)與RT-PCR技術(shù)結(jié)合起來運(yùn)用,可對(duì)形態(tài)相似而電活動(dòng)不同的結(jié)果作出分子水平的解釋,從此開始了膜片鉗與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的時(shí)代∶基因重組技術(shù),膜通道蛋白重建技術(shù)。
在形成高阻抗封接后,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前,通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行參數(shù)補(bǔ)償,以期獲得符合實(shí)際的結(jié)果。需要注意的是,應(yīng)恰當(dāng)設(shè)置放大器的帶寬,例如10kHz,這樣在電流監(jiān)測(cè)端將觀察不到超越此頻帶以外的無(wú)用信息。膜片鉗實(shí)驗(yàn)難度大、技術(shù)要求高,要掌握有關(guān)技術(shù)和方法雖不是很困難的事,但要從一大批的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中,經(jīng)過處理和分析,得出有意義、有價(jià)值的結(jié)果和結(jié)論,就顯得不那么容易,有許多需要注意和考慮的問題,包括減少噪音,避免電極前端的污染,提高封接成功率,具體實(shí)驗(yàn)過程中還需要考慮如何選取記錄模式,為記錄特定離子電流如何選擇電極內(nèi)、外液,如何選擇阻斷劑、激動(dòng)劑,如何進(jìn)行正確的數(shù)據(jù)采集等許多更為復(fù)雜的問題,還需在科研實(shí)踐中不斷地探索和解決。在膜電位改變時(shí),在電場(chǎng)的作用下,重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉,同時(shí)有電荷移動(dòng),稱為門控電流。
細(xì)胞是動(dòng)物和人體的基本單元,細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)的通信是依靠其膜上的離子通道進(jìn)行的,離子和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ),亦即產(chǎn)生生物電信號(hào)的基礎(chǔ),生物電信號(hào)通常用電學(xué)或電子學(xué)方法進(jìn)行測(cè)量。由此形成了一門細(xì)胞學(xué)科--電生理學(xué)。膜片鉗技術(shù)已成為研究離子通道的黃金標(biāo)準(zhǔn)。電壓門控性離子通道:膜上通道蛋白的帶點(diǎn)集團(tuán)在膜電位改變時(shí),在電場(chǎng)的作用下,重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉,同時(shí)有電荷移動(dòng),稱為門控電流。配體門控離子通道:神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿)、ji素等與通道蛋白上的特定位點(diǎn)結(jié)合,引起蛋白構(gòu)像的改變,導(dǎo)致通道的打開。對(duì)離子通道功能的研究,主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能。美國(guó)可升級(jí)膜片鉗電生理工具
滔博生物膜片鉗研究系統(tǒng)-細(xì)胞放電,組織切片放電,動(dòng)物放電!全細(xì)胞膜片鉗高阻抗封接
全細(xì)胞膜片鉗記錄(whole-cellpatch-clamprecording)是應(yīng)用*早,也是*廣的鉗位技術(shù),它相當(dāng)于連續(xù)的單電極電壓鉗位記錄,也就是說全細(xì)胞記錄類似于傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)記錄,但它具有更大的優(yōu)越性,如高分辨率、低噪聲、極好的穩(wěn)定性以及能控制細(xì)胞內(nèi)的成分等。全細(xì)胞記錄技采測(cè)定的是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)全部**通道的電流,記錄過程中電極的溶液取代了原細(xì)胞質(zhì)的成分。雖然膜片鉗記錄技術(shù)與*初的單電極電壓鉗位相比進(jìn)步了很多,尤其在單離子通道鉗位記錄方面,細(xì)胞或腦片的組織選擇及實(shí)驗(yàn)溶液的制備仍然是很重要的步驟。全細(xì)胞膜片鉗高阻抗封接