IgA 消化酶的 IgASAP 家族特異性消化血清和分泌型人 IgA 以生成 Fab 和 Fc 片段。IgASAP Sub1 特異性消化人 IgA1，而 IgASAP Sub1+2 同時消化人 IgA1 和 IgA2m1。 Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質(zhì)的 Fab 和 Fc 片段。為了獲得純和完整的Fab片段，使用Genovis的GingisKHAN Fab Kit進行人IgG1的消化和抗體片段的后續(xù)純化。通過與 GingisKHAN 孵育，然后在 CaptureSelect? 人 CH1 離心柱上親和純化，在曲妥珠單抗上證明了完整的片段生成。樣品的酶和Fc部分存在于色譜柱的流通中，F(xiàn)ab很容易通過降低pH洗脫。使用該試劑盒，可以制備 0.5 mg 至 2 mg 人 IgG1 的 Fab 片段。Genovis同時提供IdeS酶的純化試劑盒。使用GlySERIAS 的連接子酶切可以通過分離連接的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來幫助這種質(zhì)量控制。天津IdeS蛋白酶抗體酶切

與IdeS不同，Genovis的GlySERIAS是一種獨特的酶，可消化柔性富含甘氨酸的融合蛋白連接子，例如Gly4Ser和GlyxSery（GS）以及聚甘氨酸（G）接頭。該酶能夠分離多功能融合蛋白的各個結(jié)構(gòu)域，以促進表征并增加對這些分子的理解。融合蛋白的中級分析既可以降低整體樣品的復(fù)雜性，又可以對翻譯后修飾進行結(jié)構(gòu)域特異性鑒定和監(jiān)測。為了改善連接子的去除，Genovis建議使用GlySERIASImmobilized。對于連接子表征，我們推薦GlySERIAS凍干。具有柔性接頭的獨特酶消化融合蛋白；中級方法可降低融合蛋白表征的復(fù)雜性；復(fù)雜融合蛋白的可靠且可重復(fù)的消化。Genovis的GlySERIAS酶切由甘氨酸或甘氨酸和絲氨酸殘基的重復(fù)序列組成的柔性連接子。該酶在天然反應(yīng)條件下具有活性，能夠?qū)?fù)雜的融合蛋白進行中級表征。連接子區(qū)域同時在多個位點被消化，導(dǎo)致先前連接的組分分離?；钚园l(fā)生在pH7.6下，孵育時間可以根據(jù)所需的產(chǎn)物而變化。GlySERIAS是從噬菌體K克隆而來的，在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽，分子量為18kDa。遼寧FabRICATOR ZIdeS蛋白酶抗體酶切三個柔性 GS 連接子均被切開，這有助于識別Fc區(qū)域的修飾。

與IdeS不同，融合蛋白是通過將兩種或多種蛋白質(zhì)或肽的功能組合成一個量身定制的分子來創(chuàng)造的，以專門應(yīng)對挑戰(zhàn)。連接此類蛋白質(zhì)或肽結(jié)構(gòu)域的常見方法是包含柔性連接子。這些連接子通常富含甘氨酸，例如甘氨酸殘基（G），或甘氨酸殘基散布絲氨酸殘基（GS）以形成重復(fù)序列。這為連接子提供了足夠的靈活性，不會干擾連接蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的功能。然而，這些新模式帶來了新的分析挑戰(zhàn)，需要新的工具來促進表征和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測。中級分析已成為分析單克隆抗體療法的標(biāo)準(zhǔn)方法，涉及將分子消化成幾個定義的亞基。它們足夠小，可以獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，并為產(chǎn)品質(zhì)量屬性提供特定領(lǐng)域的信息。由于G和GS連接子對常見蛋白酶的降解具有抗性，因此很難分離結(jié)構(gòu)域以進行深入分析。因此，Genovis開發(fā)了GlySERIAS，不同于IdeS酶，一種消化柔性富含甘氨酸的連接子的酶。GlySERIAS可以分離不同的功能域，并實現(xiàn)對融合蛋白、多特異性抗體和含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進行詳細(xì)表征的中級方法。

與IdeS不同，為了獲得更均勻的度拉糖肽融合蛋白的消化產(chǎn)物，用Genovis的GlySERIAS固定化蛋白質(zhì)消化該蛋白質(zhì)，該蛋白由與瓊脂糖珠共價偶聯(lián)的GlySERIAS酶組成。通過將酶偶聯(lián)到樹脂上，可以增加酶與蛋白質(zhì)的比率，從而可以進一步加速反應(yīng)，以獲得更完整的連接子消化。此外，該酶不會存在于樣品制備中，可能會干擾樣品分析。為了進行比較，度拉糖肽在37°C下用GlySERIAS固定化過夜，或用GlySERIAS凍干1小時并在37°C下過夜消化。 為了降低樣品復(fù)雜性，使用內(nèi)切糖苷酶GlycINATOR凍干去除Fc聚糖，并減少鏈間二硫鍵。通過反相LC-MS對樣品的分析表明，GlySERIAS Immobilized幾乎完全消化了Fc結(jié)構(gòu)域中的連接子，留下了接近均質(zhì)的Fc/2產(chǎn)物，其中含有來自連接子的一個絲氨酸殘基。用 GlySERIAS 凍干 1 小時或過夜消化，兩者都會產(chǎn)生幾種 Fc 產(chǎn)物，并附著不同數(shù)量的絲氨酸和甘氨酸殘基。GLP-1肽在所有三個樣品中以兩種變體存在。使用GlySERIAS固定化消化的均質(zhì)Fc/2能夠詳細(xì)研究特定于Fc區(qū)域的質(zhì)量屬性。此外，在樣品中未觀察到干擾分析的酶峰。作為補充，F(xiàn)c/2 產(chǎn)物在用 GlySERIAS 凍干消化后殘留部分連接子，有助于研究位于 GS 連接子的修飾。Genovis提供具有低水平內(nèi)du素的FabRICATOR （IdeS）凍干。

為了讓所有實驗室都能同時快速自動消化多種抗體，Genovis的FabRICATORMagIC的設(shè)計具有靈活性，適用于一系列自動化平臺。我們在ThermoScientific?KingFisher?純化系統(tǒng)上優(yōu)化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以轉(zhuǎn)移到其他自動化平臺，如果沒有自動化，在振動臺上也能同樣出色地工作。消解后，將含有處理樣品的深孔板直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動進樣器中進行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進行分析。FabRICATORMagIC與在消解緩沖液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以極大限度地減少自動化系統(tǒng)中可能發(fā)生的純粹壓力。使用KingFisher儀器處理樣品時，樣品制備非常簡單。將樣品、樹脂和緩沖液移液到指定的孔或板中，然后將板放入儀器中。設(shè)計用于FabRICATORMagIC的BindIt?協(xié)議將控制每個步驟的孵育溫度和時間。為了分別研究度拉糖肽的肽和 Fc 區(qū)域，用GlySERIAS 在 37°C 下凍干消化1 小時。四川GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

瑞典生物技術(shù)公司Genovis提供IdeS蛋白酶等，用于mAb、ADC藥物的開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制。天津IdeS蛋白酶抗體酶切

Genovis除了提供IdeS酶以外，還提供很多種特異性蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE）。IgdE 在鉸鏈正上方的一個特定位點消化人 IgG1，產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段的均質(zhì)池。它在pH值和鹽濃度范圍內(nèi)具有活性，不需要任何還原劑或輔助因子。因此，與許多其他常用的蛋白酶相比，F(xiàn)abALACTICA不需要任何優(yōu)化來避免過度消化。這使得FabALACTICA成為一種有吸引力的酶，例如在還原和非還原條件下的LC-MS分析、抗體高階結(jié)構(gòu)（HOS）的結(jié)晶和NMR研究、雙特異性或多特異性抗體的表征、單價結(jié)合研究和完整的Fc聚糖分析。天津IdeS蛋白酶抗體酶切