冷凍電鏡技術(shù)總結(jié)：電子斷層成像技術(shù)則可用來(lái)研究一定厚度的亞細(xì)胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結(jié)構(gòu)，的也可以了解整個(gè)細(xì)胞不同層面的內(nèi)部結(jié)構(gòu).盡管，我們能夠預(yù)言按目前電子冷凍斷層成像技術(shù)的發(fā)展會(huì)得到許多更誘人的信息。細(xì)胞內(nèi)存在大量分子機(jī)器和生物大分子復(fù)合物，并且與單個(gè)超分子相比要大，更容易對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。這樣的事實(shí)使斷層技術(shù)的目標(biāo)變得簡(jiǎn)單了。在不久的將來(lái)關(guān)于細(xì)胞骨架，核孔復(fù)合體和核纖層，囊泡聚集和運(yùn)輸復(fù)合物以及其他一些細(xì)胞成分的一些基本問(wèn)題會(huì)得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)晶，快速含水冰凍的制樣過(guò)程既不復(fù)雜，又保存了樣品的瞬時(shí)天然結(jié)構(gòu)，有利于對(duì)復(fù)合物的功能進(jìn)行研究，圖像自動(dòng)化篩選過(guò)程將是今后提高分辨率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而電子晶體學(xué)則對(duì)具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)的樣品進(jìn)行三維重構(gòu)具有很大的優(yōu)勢(shì)，比如二十面體病毒，螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)等，尤其適合膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并且是電子顯微術(shù)中目前只一能達(dá)到原子分辨率水平的方法。冷凍電子顯微技術(shù)學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電子顯微鏡成像。東莞單顆粒冷凍電鏡技術(shù)特點(diǎn)

冷凍電鏡技術(shù)，是用于掃描電鏡的很低溫冷凍制樣及傳輸技術(shù)(Cryo-SEM)，可實(shí)現(xiàn)直接觀察液體、半液體及對(duì)電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。電鏡觀察：樣品經(jīng)過(guò)很低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理后，通過(guò)冷凍傳輸系統(tǒng)放入電鏡內(nèi)的冷臺(tái)（溫度可至-185℃）即可進(jìn)行觀察。其中，快速冷凍技術(shù)可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，冷凍傳輸系統(tǒng)保證在低溫狀態(tài)下對(duì)樣品進(jìn)行電鏡觀察。東莞單顆粒冷凍電鏡技術(shù)特點(diǎn)冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法的研究對(duì)象可以是具有某種對(duì)稱性的顆粒，也可不具有任何對(duì)稱性的蛋白分子。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)中電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)：電子斷層掃描技術(shù)是從一個(gè)物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)，通過(guò)獲取同一物體的多個(gè)連續(xù)角度下的二維投影圖來(lái)反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，電子斷層掃描技術(shù)就是將一個(gè)物體(樣品)沿著一個(gè)與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn)，每旋轉(zhuǎn)一個(gè)角度，采集這個(gè)物體在相對(duì)應(yīng)方向上的二維投影像，通過(guò)對(duì)這些二維投影圖的處理(相互配準(zhǔn))，將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法)，獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。電子斷層成像適合于在納米級(jí)尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與電子晶體學(xué)和單顆粒技術(shù)相比，這種技術(shù)無(wú)需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性，也不強(qiáng)調(diào)樣品具有一定的對(duì)稱性。因此，雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比，但其在研究非定形、不對(duì)稱和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的作用。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的顆粒挑選：接下來(lái)需要從原始數(shù)據(jù)中篩選出顆粒投影，也被稱為“顆粒挑選”，顆粒挑選的好壞也將影響所有后續(xù)的分析和處理過(guò)程，是一個(gè)重要并且繁瑣的步驟。顆粒挑選方式可以分為手動(dòng)挑選、半自動(dòng)挑選和完全自動(dòng)挑選這幾種。在早期的分析中，對(duì)于結(jié)構(gòu)的了解還非常少，優(yōu)先考慮的都是人工挑選。但是自動(dòng)的顆粒圖像獲取方法的出現(xiàn)使得在很短時(shí)間內(nèi)可以收集數(shù)十萬(wàn)張顆粒圖像，人工挑選大量的顆粒圖像不太現(xiàn)實(shí)，并且人工的挑選通常會(huì)過(guò)于集中于某一類顆粒圖像，導(dǎo)致遺漏和偏差。半自動(dòng)和全自動(dòng)的方法主要有以下三類：(1)通過(guò)例如降噪、反襯增強(qiáng)、邊緣算子等圖像形態(tài)學(xué)方法搜索區(qū)域，基于數(shù)字圖像處理學(xué)的原理，將顆粒圖像與背景分離開(kāi)來(lái)。(2)基于模板的方法，通過(guò)掃描數(shù)據(jù)圖像和已知的模板比較來(lái)挑選出潛在的顆粒圖像，模板的來(lái)源通常為手動(dòng)選出的數(shù)據(jù)圖像中較為清晰的顆粒圖像，或者是已知結(jié)構(gòu)的投影。(3)結(jié)合無(wú)模板和有模板的方法，通過(guò)一些有監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行顆粒挑選。冷凍電鏡技術(shù)主要應(yīng)用在單個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的分析方面。

為什么要做冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)？a.反應(yīng)樣品溶液里結(jié)構(gòu)：如有機(jī)分子組裝成的微球、囊泡、膠束、納米管、片層、水凝膠結(jié)構(gòu)等（往往一般透射拍攝到的都是溶液揮發(fā)干了之后的結(jié)構(gòu)，但是這樣的結(jié)構(gòu)無(wú)論是形貌和尺寸和溶液里都有一定差別，現(xiàn)在好多文章的審稿意見(jiàn)都會(huì)需要這類結(jié)構(gòu)的透射照片在溶液里的真實(shí)形貌，說(shuō)簡(jiǎn)單了就是讓補(bǔ)一個(gè)冷凍透射）；b.不穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)：比如經(jīng)不起強(qiáng)電子束照射的樣品（MOF、COF等若相互作用力結(jié)合的材料，如金屬配位、氫鍵相互作用、親疏水作用力、ππ堆疊等）在強(qiáng)電子束照射下結(jié)構(gòu)會(huì)坍塌，冷凍電鏡全程在-160℃下可以做到對(duì)樣品損害較小；c.生物類分子好多都需要冷凍，因?yàn)樯锓肿颖旧矶夹枰谒蛘哐旱却婊?，一些生物樣品?gòu)筑的一些納米結(jié)構(gòu)，如納米微球、囊泡、膜、多孔材料等等。冷凍電子顯微鏡技術(shù)具有研究對(duì)象普遍、樣品需求量少、更接近生理狀態(tài)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。黃石冷凍透射電鏡技術(shù)應(yīng)用

冷凍電鏡技術(shù)將生物分子進(jìn)行冷凍便可進(jìn)行高分辨率成像，還具有分辨率高等優(yōu)勢(shì)。東莞單顆粒冷凍電鏡技術(shù)特點(diǎn)

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：做好前面的工作就需要設(shè)定較佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動(dòng)程序框取那些離散的分子形成的投影圖。然后就是三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對(duì)非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個(gè)初始的3D模型，然后對(duì)捕獲的單顆粒2D圖像進(jìn)行分選。東莞單顆粒冷凍電鏡技術(shù)特點(diǎn)