冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來(lái)重構(gòu)被測(cè)物體的立體構(gòu)型，利用計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測(cè)定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過(guò)程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢(shì)密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運(yùn)用中心截面定理，從而可以通過(guò)三維物體不同角度的二維投影在計(jì)算機(jī)內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來(lái)解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)將在研究對(duì)象、分辨率水平和研究方法等各個(gè)方面取得重大進(jìn)展。廣州低溫冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)公司

冷凍電子顯微鏡技術(shù)中電子斷層掃描重構(gòu)技術(shù)：電子斷層掃描技術(shù)是從一個(gè)物體的投影圖像重構(gòu)獲得物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的技術(shù)，通過(guò)獲取同一物體的多個(gè)連續(xù)角度下的二維投影圖來(lái)反向重構(gòu)它的三維結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，電子斷層掃描技術(shù)就是將一個(gè)物體(樣品)沿著一個(gè)與電子束垂直的軸旋轉(zhuǎn)，每旋轉(zhuǎn)一個(gè)角度，采集這個(gè)物體在相對(duì)應(yīng)方向上的二維投影像，通過(guò)對(duì)這些二維投影圖的處理(相互配準(zhǔn))，將不同角度的二維投影圖反向重構(gòu)(如加權(quán)背投影等方法)，獲得樣品整體三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。電子斷層成像適合于在納米級(jí)尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。與電子晶體學(xué)和單顆粒技術(shù)相比，這種技術(shù)無(wú)需樣品顆粒具有結(jié)構(gòu)同一性，也不強(qiáng)調(diào)樣品具有一定的對(duì)稱(chēng)性。因此，雖然目前電子斷層成像所獲得的結(jié)構(gòu)的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術(shù)相比，但其在研究非定形、不對(duì)稱(chēng)和不具全同性的生物樣品的三維結(jié)構(gòu)和功能中有著不可替代的作用。廣州低溫冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)公司冷凍電鏡技術(shù)就是在傳統(tǒng)透射電子顯微鏡之上，加上了低溫傳輸系統(tǒng)和冷凍防污染系統(tǒng)。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之樣品制備：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的制備既要能夠保持本身的結(jié)構(gòu)又能抗脫水、電子輻射。現(xiàn)在普遍采用的方法是通過(guò)快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態(tài)，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包埋在一層較樣品略高的薄冰內(nèi)。冰的結(jié)構(gòu)多種多樣，包括六角形冰、立方體冰等，其物理狀態(tài)與冷凍速率有關(guān)。若要形成玻璃態(tài)(即無(wú)定形態(tài))的冰，需要冷凍速率達(dá)到每秒鐘104攝氏度。此時(shí)，冰的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)各向同性，不會(huì)因成像角度不同而導(dǎo)致圖像產(chǎn)生偏差。該方法有兩個(gè)步驟:一是將樣品在載網(wǎng)上形成一薄層水膜:二是將第步獲得的含水薄膜樣品快速冷凍。在多數(shù)情況下，用手工將載網(wǎng)迅速浸入液氮內(nèi)可使水冷凍成為玻璃態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)在于將樣品保持在接近生活狀態(tài)，不會(huì)因脫水而變形，同時(shí)可以減少輻射損傷。

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過(guò)專(zhuān)門(mén)的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對(duì)高能電子的輻射敏感，照相時(shí)必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過(guò)透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過(guò)程，較終在記錄介質(zhì)上會(huì)形成樣品放大幾千倍至幾十萬(wàn)倍的圖像。利用計(jì)算機(jī)對(duì)這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，一個(gè)技術(shù)上的重大突破是高分辨率圖像采集設(shè)備的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用?；诨パa(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)技術(shù)開(kāi)發(fā)的直接探測(cè)電子成像的裝置使電子顯微放大圖像的信噪比相對(duì)過(guò)去所使用的底片或電荷耦合元件(CCD)有了很大提高、進(jìn)而提高了成像的質(zhì)量。冷凍電鏡技術(shù)中單顆粒分析法優(yōu)點(diǎn)：樣品受總輻射值小；對(duì)稱(chēng)顆粒的解析分辨率更高。

為什么要做冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)服務(wù)？a.反應(yīng)樣品溶液里結(jié)構(gòu)：如有機(jī)分子組裝成的微球、囊泡、膠束、納米管、片層、水凝膠結(jié)構(gòu)等（往往一般透射拍攝到的都是溶液揮發(fā)干了之后的結(jié)構(gòu)，但是這樣的結(jié)構(gòu)無(wú)論是形貌和尺寸和溶液里都有一定差別，現(xiàn)在好多文章的審稿意見(jiàn)都會(huì)需要這類(lèi)結(jié)構(gòu)的透射照片在溶液里的真實(shí)形貌，說(shuō)簡(jiǎn)單了就是讓補(bǔ)一個(gè)冷凍透射）；b.不穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)：比如經(jīng)不起強(qiáng)電子束照射的樣品（MOF、COF等若相互作用力結(jié)合的材料，如金屬配位、氫鍵相互作用、親疏水作用力、ππ堆疊等）在強(qiáng)電子束照射下結(jié)構(gòu)會(huì)坍塌，冷凍電鏡全程在-160℃下可以做到對(duì)樣品損害較小；c.生物類(lèi)分子好多都需要冷凍，因?yàn)樯锓肿颖旧矶夹枰谒蛘哐旱却婊?，一些生物樣品?gòu)筑的一些納米結(jié)構(gòu)，如納米微球、囊泡、膜、多孔材料等等。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備。常州低溫冷凍透射電鏡技術(shù)原理

基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)已經(jīng)逐漸成為藥物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的主流，與此同時(shí)冷凍電鏡技術(shù)也在蓬勃發(fā)展。廣州低溫冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)公司

冷凍電鏡技術(shù)是什么呢？冷凍電鏡用于生物樣品三維結(jié)構(gòu)解析，包含單顆粒分析、微晶電子衍射和冷凍電子斷層掃描3種技術(shù)。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)（cryo-EMSPA）是一種以單顆粒形式分析生物分子組裝的新方法，通過(guò)將負(fù)染電鏡篩選獲得的合適濃度的生物分子樣品快速冷凍，使生物大分子以近天然狀態(tài)存在于無(wú)定形冰中，然后進(jìn)行冷凍樣品的篩選、數(shù)據(jù)收集和三維結(jié)構(gòu)解析，從而獲得高分辨率的生物分子結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)能夠從分子層面進(jìn)行詳細(xì)的研究，解析基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)的分子基礎(chǔ)，而冷凍電子斷層掃描能夠從亞細(xì)胞水平觀察目標(biāo)分子在原位細(xì)胞環(huán)境中的作用位點(diǎn)和作用機(jī)制，相信在不久的將來(lái)能夠用于進(jìn)一步確認(rèn)基于結(jié)構(gòu)的藥物研究的可靠性。微晶電子衍射不只能夠進(jìn)行小分子微晶結(jié)構(gòu)解析，也可與現(xiàn)有技術(shù)互補(bǔ)，進(jìn)行生物大分子及其復(fù)合物的微晶結(jié)構(gòu)解析。廣州低溫冷凍透射電鏡技術(shù)服務(wù)公司

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