冷凍電子顯微技術(shù)的發(fā)展與完善經(jīng)歷了復(fù)雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結(jié)構(gòu)，揭開它的廬山真面目。樣品制備：樣品快速冷凍技術(shù)：樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標本制備的開始。冷凍電鏡采用的快速冷凍技術(shù)關(guān)鍵在于“快速”。這是由于：采用常規(guī)冷凍手段，水分子會在氫鍵作用下形成冰晶，一來會改變樣品結(jié)構(gòu)，二來在成像過程中，冰晶體會產(chǎn)生強烈的電子衍射掩蓋樣品信號。而當(dāng)冷凍速率足夠快時，水分子在形成晶體之前就會凝固成無定形的玻璃態(tài)冰，具有非晶態(tài)特性，保證了在電子束探測成像的過程中不會對樣品成像造成干擾。冷凍固定時，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態(tài)乙烷中。采用液態(tài)乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結(jié)構(gòu)就得到了保持和固定，同時玻璃化冰也不會在真空環(huán)境中揮發(fā)，在一定程度上保護了樣品免受電子輻射的損傷。冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可不具有任何對稱性的蛋白分子。嘉興TEM技術(shù)品牌

冷凍電子顯微鏡技術(shù)之樣品成像：低劑量輻照成像，普通的樣品材料在進行TEM表征時，電子劑量越高，成像質(zhì)量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關(guān)的。更詳細一點說，隨著輻照劑量的增加，輻照損傷對高分辨細節(jié)的破壞更嚴重。因此，為了盡可能地獲得更多的細節(jié)，就必須要對樣品采用用低劑量輻照成像。在冷凍電鏡技術(shù)中，常用的低劑量輻照成像法有兩種：冷凍電子斷層掃描法，單顆粒分析成像法。冷凍電鏡技術(shù)中的電子斷層掃描技術(shù)（cryogeniccomputedtomography）：進行斷層掃描時，樣品被連續(xù)不停地旋轉(zhuǎn)，并在每個旋轉(zhuǎn)角度上都進行一次成像。每一幅電子顯微像是物體在不同投影方向的二維投影像,經(jīng)傅立葉變換會得到一系列不同取向的截面，當(dāng)截面足夠多時，會得到傅立葉空間的三維信息，再經(jīng)傅立葉反變換便能得到物體的三維結(jié)構(gòu)。蘇州冷凍透射電鏡技術(shù)應(yīng)用冷凍電鏡技術(shù)中單顆粒分析法優(yōu)點：樣品受總輻射值??；對稱顆粒的解析分辨率更高。

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構(gòu)被測物體的立體構(gòu)型，利用計算機數(shù)字圖像處理技術(shù)進行電子顯微像三維重構(gòu)測定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機內(nèi)進行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)二維圖像分析——顆粒圖像的匹配與分類：二維顆粒圖像的分類是獲取三維結(jié)構(gòu)過程的第一步。對二維圖像的分析包括兩部分：顆粒圖像的匹配和顆粒圖像的分類。匹配的過程通常會對顆粒圖像應(yīng)用一些變換操作，通過關(guān)聯(lián)函數(shù)去判斷不同顆粒圖像之間的相似程度。圖像匹配的算法主要分為兩種，即不依賴模型的方法和基于模型的方法，取決于是否存在利用樣本先驗信息得到的模板。隨著圖像匹配的完成，顆粒圖像需要進行分類。主要利用多元統(tǒng)計分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二維顆粒分類技術(shù)還有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類，將圖像在二維空間自組織映射(self-organisingmapping，SOM)再進行分類和排序。二維圖像分析的目的是，首先通過圖像匹配消除旋轉(zhuǎn)和平移的誤差，利用類內(nèi)緊致、類間離散的原則進行圖像分類，較終可以對類內(nèi)顆粒圖像進行平均，提高信噪比，從而實現(xiàn)對高分辨率三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點：能耐受電子束轟擊和長期保存。

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：做好前面的工作就需要設(shè)定較佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動程序框取那些離散的分子形成的投影圖。然后就是三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個初始的3D模型，然后對捕獲的單顆粒2D圖像進行分選。冷凍電鏡技術(shù)采用的快速冷凍技術(shù)關(guān)鍵在于“快速”。蘇州冷凍透射電鏡技術(shù)應(yīng)用

冷凍電鏡技術(shù)既完美契合了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，又能夠助力加速基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)。嘉興TEM技術(shù)品牌

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)樣品的篩選和數(shù)據(jù)采集：在開始高分辨數(shù)據(jù)采集前，可以利用冷凍電鏡先對樣品質(zhì)量進行評估，包括但不限于蛋白濃度、穩(wěn)定性和分布，冰層厚度、質(zhì)量和載網(wǎng)各處的均一性等的檢查。用戶可以在120kV電鏡或200kV電鏡上進行此篩樣過程。待到樣品通過篩選，用戶可以利用300kV或200kV電鏡采集更大的數(shù)據(jù)量來幫助開展2D和3D分析。200kV-TalosArctica透射電鏡配備了直接電子探測相機FalconIII,在樣品質(zhì)量較高時，較高可以獲得<3?的數(shù)據(jù)。目前的300kV-TitianKrios透射電鏡有兩套，其中一臺配備了目前行業(yè)前列的K3直接電子探測相機，另一臺配備有K2相機和能量過濾器，兩套電鏡均能夠進行全自動、長時間無人照看的數(shù)據(jù)收集操作，可實現(xiàn)樣品的大規(guī)模數(shù)據(jù)采集，并獲得極高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。收集得到數(shù)以萬計的單顆粒物照片后，用戶可以使用平臺集群已安裝的常用三維重構(gòu)計算軟件以及相關(guān)生物軟件對數(shù)據(jù)集進行計算處理。嘉興TEM技術(shù)品牌

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