外泌體（Exosomes）是細(xì)胞分泌到胞外的一種囊泡（ExtracellularVesicles，EVs），其大小為30-150nm，具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內(nèi)含物（包括核酸、蛋白和脂質(zhì)等），參與細(xì)胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、唾液、尿液、乳汁等，同時(shí)也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。腦組織分離方法簡(jiǎn)述：將腦組織剪成薄片，放入離心管中加上消化液進(jìn)行消化，經(jīng)水浴、反復(fù)輕輕上下顛倒，再用移液間斷緩慢吹吸至消化結(jié)束。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中，混勻，置于冰上。再進(jìn)行一系列的差速超速離心過(guò)程，包括除雜、濾膜過(guò)濾、超離等。結(jié)尾用PBS重懸外泌體，用重懸后的外泌體進(jìn)行下面的透射電鏡（TEM）、納米粒徑追蹤分子（NTA）和markerWB鑒定。膜受體的識(shí)別是外泌體細(xì)胞反應(yīng)的基礎(chǔ)，它可能活躍受體并隨后導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路的活躍。外泌體使用方法

流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法，其用于外泌體定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進(jìn)行標(biāo)記，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的定量。但流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)時(shí)需要單顆粒懸浮液，當(dāng)外泌體濃度高或分離過(guò)程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時(shí)將導(dǎo)致一次觀察到多個(gè)顆粒，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此，為了通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察，需要將外泌體通過(guò)免疫捕獲或共價(jià)結(jié)合固定在磁珠表面上，從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達(dá)的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細(xì)胞術(shù)之前，可以在落射熒光顯微鏡（EPI）下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡。當(dāng)樣品通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)采集熒光信號(hào)，不只可以對(duì)外泌體進(jìn)行高通量分析，還可以基于抗原表達(dá)對(duì)外泌體進(jìn)行定量或分類。海洋生物外泌體熒光標(biāo)記疾病的進(jìn)展和對(duì)診療的反應(yīng)可以通過(guò)外泌體的多組分分析來(lái)確定。

被特定部位的細(xì)胞獲取的瘤子外泌體可為肉瘤的轉(zhuǎn)移準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。用肺轉(zhuǎn)傾向的肉瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理小鼠后可使骨轉(zhuǎn)傾向的肉瘤細(xì)胞重新定向。外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同部位傾向性的肉瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有不同的整合素（integrin）表達(dá)譜，整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)有關(guān)，而整合素αvβ5與肝轉(zhuǎn)有關(guān)。敲低整合素α6β4和αvβ5可減少外泌體被靶部位細(xì)胞獲取，進(jìn)而分別降低了肺和肝的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體整合素被細(xì)胞獲取后活躍了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表達(dá)。通過(guò)臨床數(shù)據(jù)分析顯示外泌體整合素可作為預(yù)測(cè)肉瘤轉(zhuǎn)移的部位傾向性的診斷指標(biāo)。

外泌體的來(lái)源與特征：外泌體是一種存在于細(xì)胞外的多囊泡體，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成，其大小均一，直徑為40-100nm，密度為1.10-1.18g/mL。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腫細(xì)胞細(xì)胞等多種類型細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放。外泌體內(nèi)主要含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，可作為疾病診斷標(biāo)記物、調(diào)控靶細(xì)胞功能、參與細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)等。例如：含有miR-140-5p的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體(SMSC-Exo影響軟骨組織再生；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體攜帶的miR-196a可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨再生。外泌體作為核酸的藥物遞送載體。外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA。

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA，主要為mRNA和lncRNA、circRNA等非編碼RNA。外泌體中攜帶有來(lái)自母本細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)、脂類、短鏈RNA和長(zhǎng)鏈RNA等重要信息。對(duì)外泌體中的長(zhǎng)鏈RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，不只能夠篩選外泌體攜帶的特異Biomarker，同時(shí)對(duì)深入了解疾病或不同發(fā)育階段的內(nèi)在機(jī)制也有重要意義。外泌體全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序體系，充分結(jié)合了微量核酸建庫(kù)技術(shù)、NGS技術(shù)和全新的生物信息序列比對(duì)算法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)1mL血漿中的外泌體即可進(jìn)行mRNA、lncRNA和circRNA等RNAs充分測(cè)序，獲取周全的外泌體轉(zhuǎn)錄組信息。免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一，其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合。杭州CD81外泌體慢病毒

一個(gè)推測(cè)的作用是外泌體可能從細(xì)胞中去除多余和/或不必要的成分以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。外泌體使用方法

NTA技術(shù)已被作為外泌體表征手段之一，相較于其他表征方式NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度更快。大致方法是：將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀，用激光光束穿過(guò)樣本，激光在腔室內(nèi)與顆粒相互作用時(shí)會(huì)發(fā)生散射，通過(guò)裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光，捕捉外泌體的布朗運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)顆?？梢暬Ｈ缓笫褂肧tokes-Einstein方程來(lái)測(cè)量粒子的平均速度，繼而估算粒子的大小。NTA能夠測(cè)量粒徑10-1000nm之間的顆粒，包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍，但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數(shù)據(jù)收集和分析參數(shù)，另外，NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)聚集體，因此無(wú)法排除其他物質(zhì)的干擾。外泌體使用方法

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