免疫組化的抗原修復(fù)

很多抗原的可視性可以通過抗原修復(fù)來提高，抗原修復(fù)可以打破福爾馬林固定時形成的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而使被掩藏的抗原顯現(xiàn)出來?？乖迯?fù)技術(shù)包括不同時間長度的加熱或者利用蛋白酶來做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。加熱的方法通常會用到微波爐，高壓鍋，蒸箱或水浴。將樣品在接近100°C高溫加熱20分鐘后再冷卻同等的時間。**常用的抗原修復(fù)液有a)檸檬酸鹽緩沖劑,pH6.0,b)Tris-EDTA,pH9.0和c)EDTA,pH8.0.如需要可用檸檬酸鹽緩沖劑做抗原修復(fù)：檸檬酸鹽緩沖劑配方:10mM檸檬酸鈉,0.05%Tween-20,pH6.0或10mM檸檬酸,0.05%Tween-20,pH6.0將含有檸檬酸鈉或檸檬酸鹽緩沖劑的染色盤放到蒸箱或者水浴中，預(yù)熱到95-100°C。將切片浸沒于染色盤中。蓋子虛掩，孵育20-40分鐘(研究者需自己決定比較好的孵育時間)。關(guān)掉蒸箱或水浴，將染色盤置于室溫下，讓切片冷卻20分鐘。在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分鐘。開始封閉步驟。 如何做好免疫組化實驗？浙江免疫組化多少錢

英瀚斯生物為您整理免疫組化實驗步驟

1、石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，脫蠟至水，用PBS沖洗三次，每次5min。

2、切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。

3、自然冷卻后PBS洗3次，每次5min。4、切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。

5、PBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封閉20min（封閉電荷）。

6、去除BSA液，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過夜。

7、PBS洗3次，每次5min。

8、去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應(yīng)種屬的二抗，4℃孵育50min。

9、PBS洗3次，每次5min。

10、去除PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。

11、顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化（1s），自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。

12、切片經(jīng)過梯度酒精（70-100%）10min一個梯度，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。 四川小鼠免疫組化可以做什么免疫組化可以看什么？

免疫組化原理及實驗步驟——實驗外包。眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第1抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，形成抗原 - 一抗 - 二抗復(fù)合物，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。

免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索比較好濃度。

2、抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是比較好的時間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低。

4、血清封閉時間過長。

5、DAB孵育時間過短。

6、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化，建議一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等問題。 免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點！

免疫組化實驗所用的組織和細胞標本是什么樣的？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本**常用、**基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復(fù)，是免疫組化中優(yōu)先的組織標本制作方法。

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做免疫組化時如何選擇一抗？

1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2、應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標明石蠟切片或冰凍切片。

3、種屬反應(yīng)性的選擇（speciesreactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差別，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。

4、種屬來源，一般兔來源的多是多克隆抗體；而小鼠來源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。

5、生產(chǎn)廠家的選擇。

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