光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了條件與可能。因此，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在動物體內(nèi)，如何實現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實時在體成像監(jiān)測是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問題。這是也生物學(xué)、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認(rèn)識疾病的發(fā)展規(guī)律，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響。精確測量細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，多光子顯微鏡技術(shù)走在科技前沿。清醒動物多光子顯微鏡實驗操作

單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長。美國高速高分辨率多光子顯微鏡峰值功率密度多光子顯微鏡，突破光學(xué)成像技術(shù)極限，開啟生命科學(xué)新紀(jì)元。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細(xì)胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常有必要的。

我們要指出的是，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu)，其目的是為了，通過共焦結(jié)構(gòu)，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統(tǒng)，相對來說，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu)，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。滔博生物-三維顯微鏡-適用于各行各業(yè)的觀察需求!

Ca2+是一種重要的第二信使，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理反應(yīng)中起著重要作用。發(fā)展和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)觀測Ca2+熒光信號，可以從某些方面分析生物體或細(xì)胞的變化機(jī)制，具有重要意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)，我們可以觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時間和空間熒光圖像的變化，也可以觀察到一定水平或部分細(xì)胞內(nèi)(Ca2+)的熒光圖像和變化。通過對單個細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+的分布不僅在細(xì)胞的局部區(qū)域之間是不均勻的，而且在細(xì)胞內(nèi)不同深度或?qū)哟蔚木植繀^(qū)域之間也存在不同程度的Ca2+梯度，稱為空間Ca2+梯度。滔博生物多光子顯微鏡具有出色的成像深度和分辨率!美國離體多光子顯微鏡配置

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。清醒動物多光子顯微鏡實驗操作

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對焦時對反射鏡的機(jī)械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差，無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描，以實現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實現(xiàn)這種設(shè)計。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個垂直臂組成，每個臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點可以進(jìn)行水平掃描。清醒動物多光子顯微鏡實驗操作