多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對(duì)神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像。該技術(shù):對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上)，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。多光子顯微鏡，突破生物組織成像深度，洞察細(xì)胞間的奧秘。高速高分辨率多光子顯微鏡技術(shù)
快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡成像深度更多關(guān)于多光子顯微鏡的信息有哪些？
細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化。
我們要指出的是，單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機(jī)理上來(lái)區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結(jié)構(gòu)，其目的是為了，通過(guò)共焦結(jié)構(gòu)，提高整個(gè)熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實(shí)現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個(gè)普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結(jié)構(gòu)）其空間分辨率也可以達(dá)到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng)，相對(duì)來(lái)說(shuō)，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測(cè)效率，這個(gè)也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應(yīng)和共焦結(jié)構(gòu)，分辨率則會(huì)更高，而我們通常說(shuō)的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。多光子顯微鏡，突破光學(xué)成像技術(shù)極限，開啟生命科學(xué)新紀(jì)元。
當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上，此時(shí)被反射的激光在無(wú)限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會(huì)形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn)，這又導(dǎo)致返回的光束會(huì)聚或發(fā)散，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過(guò)這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對(duì)于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動(dòng)力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦，該技術(shù)可對(duì)大腦組織和斑馬魚心臟動(dòng)力學(xué)進(jìn)行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。突破光學(xué)成像技術(shù)的限制，多光子顯微鏡為科研工作提供新思路。嚙齒類多光子顯微鏡層析成像
融合先進(jìn)激光技術(shù)，多光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)高速、高清晰度成像。高速高分辨率多光子顯微鏡技術(shù)
要想實(shí)現(xiàn)離散的軸向重新聚焦，需要在OBJ1的焦平面中放置一個(gè)階梯鏡（圖3b）。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時(shí)，被反射的激光將在無(wú)窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑。并且返回的激光束會(huì)被GSM消除橫向掃描，即OBJ2形成的焦點(diǎn)不會(huì)進(jìn)行橫向掃描，實(shí)現(xiàn)軸向掃描。如果激光點(diǎn)被掃描到與焦平面不一致的階梯，則會(huì)形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點(diǎn)，返回的激光束會(huì)在無(wú)窮大的空間中會(huì)聚或發(fā)散，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點(diǎn)也在軸向重新聚焦，通過(guò)這種方式即能實(shí)現(xiàn)離散的軸向掃描。對(duì)于已精確匹配兩個(gè)物鏡光瞳的光學(xué)裝置，不會(huì)引入像差。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡，同時(shí)入射的激光焦點(diǎn)也需要被傾斜，使得其以垂直于鏡面的方向入射，通過(guò)相對(duì)入射激光束稍微平移OBJ1即可實(shí)現(xiàn)這種傾斜。高速高分辨率多光子顯微鏡技術(shù)
