傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠對大腦淺層的神經元或在離體組織上進行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進行在體成像的時候實現高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進行成像，研究神經元突觸后長時程降低(Wangetal.,2000)；觀察在體小鼠運動皮層神經元在嗅覺選擇任務中刺激相關電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過，這些實驗還是需要對動物進行麻醉和固定，而神經科學領域很多研究更希望能夠對自由活動的動物進行研究。近年來出現了通過植入性的microscope或microlens進行在體freelymoving動物鈣成像的技術。使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動物大腦，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號被光纖收集，然后通過Inscopix顯微鏡成像。動物頭部只需植入GRINlens，方便活動。鈣信號在神經元功能調控及信息傳遞方面發(fā)揮著重要作用。浙江神經細胞鈣成像大概費用
轉基因Ca2+指示劑：轉基因技術和光遺傳技術的飛速發(fā)展，催生了基因編碼的Ca2+指示劑（GECIs）。它們不依賴于熒光染料，可以靶向特定的組織，如神經細胞、心肌細胞、T細胞等，并且可以避免熒光指示劑帶來的的許多問題，是監(jiān)測轉基因動物體內鈣離子的一個極好的工具。個基因編碼的鈣離子指示劑Cameleon早在1997年就發(fā)表了。它是利用與鈣離子結合后發(fā)生結構變化，作為供體的CFP和作為受體的YFP之間產生FRET的原理。2000年，GCaMP誕生了。它是增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和鈣調蛋白（結合鈣離子）、鈣調蛋白結合肽M13組成的，結合鈣離子后，鈣調素-M13相互作用引起GFP空間結構變化，發(fā)出綠色熒光（圖5）。GCaMP的問世有著**性的意義，它改變了我們觀察神經元群體活動的方式，讓科學家們可以在成千上萬的細胞中，看到哪些神經元在放電，它們放電的模式和規(guī)律是怎樣的，從而進一步探索各種內在的神經機制。江蘇鈣成像供應商利用鈣離子指示劑檢測組織或細胞內鈣離子濃度，進而反應組織或細胞內某些活動或反應。
單光子顯微技術是較成熟的熒光顯微技術，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應用于活細胞內的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現多維成像。Derrick想重點介紹一下較為常用的觀察設備——雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術是近些年發(fā)展起來的結合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術能準確定位細胞內置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經細胞單個樹突棘中的鈣分布。
多種鈣離子指示劑和鈣成像手段的存在使研究人員能夠根據具體的實驗需要進行選擇。同樣，選擇合適的檢測設備也是至關重要的。對于使用CCD/sCMOS相機的成像系統(tǒng)來說，有兩個要求是很基本的：采集速度：根據不同的應用所需的相機幀速也不同，對于神經細胞來說，一般要求相機速度至少在10fps以上，有些高速應用場景可能需要幾百甚至上千Hz的幀速。靈敏度：為了盡可能降低光漂白和其他副作用（特別是藍光激發(fā)時），需要降低激發(fā)光強度。因此相機要在較寬的發(fā)射光波長范圍上具有高靈敏度，才能檢測到弱光條件下的信號，并適應不同的染料的光譜發(fā)射特性。通過鈣成像技術檢測活動動物記錄神經元的活動。
細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當di1個細胞興奮時，產生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內，促使該細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來，以反映神經元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞。鈣成像顯微鏡由軟件控制的電子對焦方式，讓成像更加穩(wěn)定清晰。浙江神經細胞鈣成像大概費用
鈣成像系統(tǒng)具有單細胞分辨率的大視野的特征。浙江神經細胞鈣成像大概費用
鈣成像技術是一種監(jiān)測組織內鈣離子濃度的方法，通過使用鈣離子指示劑，科學家可以觀察神經信號在神經網絡中的傳遞過程，并了解神經元活動與內部鈣離子濃度的關系。在靜息狀態(tài)下，大部分神經元的胞內鈣離子濃度為50-100nM，而當神經元活動的時候，胞內鈣離子濃度能上升10-100倍，增加的鈣離子對于含有神經遞質的突觸囊泡的胞吐釋放過程必不可少。鈣成像是一種生物醫(yī)學技術，主要用于觀察和記錄細胞內鈣離子濃度的變化。鈣離子是細胞內重要的信號分子，其濃度的改變可以影響細胞的生理功能和病理狀態(tài)。因此，鈣成像技術對于研究細胞生物學、神經科學、心血管醫(yī)學等領域具有重要意義。浙江神經細胞鈣成像大概費用
