膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合Neher等**將膜片鉗技術(shù)與Fura2熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合，同時(shí)進(jìn)行如細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞膜離子通道電流及細(xì)胞膜電容等多指標(biāo)變化的快速交替測(cè)定，這樣便可得出同一事件過程中，多種因素各自的變化情況，進(jìn)而可分析這些變化間的相互關(guān)系。Neher將可光解出鈣離子的鈣螯合物引入膜片鉗技術(shù)，進(jìn)而可以定量研究鈣離子濃度與分泌率的關(guān)系及比較大分泌率等指標(biāo)。他又創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測(cè)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)聯(lián)合運(yùn)用的技術(shù)。之后又將光電聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)首先結(jié)合起來。這種結(jié)合既能研究分泌機(jī)制，又能鑒別分泌物質(zhì)，還能互相彌補(bǔ)各單種方法的不足。Eberwine等于1991年首先將膜片鉗技術(shù)與RT-PCR技術(shù)結(jié)合起來運(yùn)用，可對(duì)形態(tài)相似而電活動(dòng)不同的結(jié)果作出分子水平的解釋，從此開始了膜片鉗與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的時(shí)代∶基因重組技術(shù)，膜通道蛋白重建技術(shù)。膜片鉗記錄不但能夠在神經(jīng)元胞體及其樹突上進(jìn)行，而且可同時(shí)在這兩個(gè)不同的部位作膜片鉗記錄。日本多通道膜片鉗專題
對(duì)藥物作用機(jī)制的研究，在通道電流記錄中，可分別于不同時(shí)間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對(duì)通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動(dòng)物生理功能的分子機(jī)理。這是目前膜片鉗技術(shù)應(yīng)用普遍的領(lǐng)域，既有對(duì)西藥藥物機(jī)制的探討，也普遍用在重要藥理的研究上。如開麗等報(bào)道細(xì)胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀測(cè)到人參二醇組皂苷可控制正常和“缺血”誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元L-型鈣通道的開放，從而減少鈣內(nèi)流，對(duì)缺血細(xì)胞可能有保護(hù)作用。陳龍等報(bào)道采用細(xì)胞貼附式單通道記錄法發(fā)現(xiàn)烏頭堿對(duì)培養(yǎng)的Wistar大鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣通道有阻滯作用。多通道膜片鉗細(xì)胞功能特性滔博生物專業(yè)膜片鉗檢測(cè)團(tuán)隊(duì),不是中間商,沒有中介費(fèi),先檢測(cè)后付款.
向電極連續(xù)施加1mV、10~50ms的階躍脈沖，電極入水后電阻約為4~6mΩ。此時(shí)，在計(jì)算機(jī)屏幕顯示框中可以看到測(cè)試脈沖產(chǎn)生的電流波形。剛開始的時(shí)候增益不要設(shè)置太高，一般可以是1~5mV/PA，避免放大器飽和。由于細(xì)胞外液和電極液離子組成的差異導(dǎo)致液體接界電位，電極剛?cè)胨畷r(shí)測(cè)試波形的基線不在零線上。因此，需要將保持電壓設(shè)置為0mV，并調(diào)整“電極不平衡控制”，使電極DC電流接近于零。當(dāng)使用微操作器使電極靠近細(xì)胞時(shí)，當(dāng)電極前緣接觸細(xì)胞膜時(shí)，密封電阻指標(biāo)Rm會(huì)上升，當(dāng)電極輕微下壓時(shí)，Rm指標(biāo)會(huì)進(jìn)一步上升。當(dāng)通過細(xì)塑料管對(duì)電極施加輕微負(fù)壓，且細(xì)胞膜特性良好時(shí)，Rm一般會(huì)在1min內(nèi)迅速上升，直至形成Gω級(jí)高阻密封。一般在Rm達(dá)到100MΩ左右時(shí)，在電極前端施加一個(gè)輕微的負(fù)電壓(-30~-30~-10mV)，有利于gω密封的形成。此時(shí)的現(xiàn)象是電流波形再次變平，使電極從-40到-90mV超極化，有助于加速形成密封。為了確認(rèn)gωseal的形成，可以提高放大器的增益，因此可以觀察到除了脈沖電壓開始和結(jié)束時(shí)的容性脈沖超前電流外，電流波形仍然是平坦的。
在膜片鉗技術(shù)的發(fā)展過程中主要形成了五種記錄模式，即細(xì)胞貼附模式（cell-attachedmode或loose-seal-cellattachedmode）、膜內(nèi)面向外模式（inside-outmode）、膜外面向外模式（outside-outmode）、常規(guī)全細(xì)胞模式（conventionalwhole-cellmode）和穿孔膜片模式（perforatedpatchmode）。a.亞細(xì)胞水平：細(xì)胞貼附模式，可記錄通過電極下膜片中通道蛋白的離子電流(紅色虛線箭頭)。在全細(xì)胞膜片鉗中，膜片破裂，因此可以記錄全細(xì)胞的宏觀電流，它表示整個(gè)細(xì)胞的總和電流(藍(lán)色虛線箭頭)。b.細(xì)胞水平：來自神經(jīng)元不同部分的全細(xì)胞同步記錄可確定信號(hào)傳遞的方向。c.神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)水平：全細(xì)胞記錄可以在一個(gè)連接神經(jīng)元的小網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行。d.活物水平：可以在執(zhí)行任務(wù)或自由走動(dòng)的動(dòng)物大腦中進(jìn)行全細(xì)胞記錄。膜片鉗，為您的科研之路增添一雙慧眼！
1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)，記錄到ACh的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負(fù)壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），明顯降低了記錄時(shí)的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。1981年Hamill和Neher等對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時(shí)間分辨率。1983年10月，《Single-ChannelRecording》一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn)，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。全細(xì)胞膜片鉗記錄是應(yīng)用較早，也是普遍的鉗位技術(shù)。日本多通道膜片鉗專題
在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)，記錄到ACh啟動(dòng)的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。日本多通道膜片鉗專題
高阻封接技術(shù)還明顯降低了電流記錄的背景噪聲，從而戲劇性地提高了時(shí)間、空間及電流分辨率，如時(shí)間分辨率可達(dá)10μs、空間分辨率可達(dá)1平方微米及電流分辨率可達(dá)10-12A。影響電流記錄分辨率的背景噪聲除了來自于膜片鉗放大器本身外，較主要還是信號(hào)源的熱噪聲。信號(hào)源如同一個(gè)簡(jiǎn)單的電阻，其熱噪聲為σn=4Kt△f/R式中σn為電流的均方差根，K為波爾茲曼常數(shù)，t為溫度，△f為測(cè)量帶寬，R為電阻值。可見，要得到低噪聲的電流記錄，信號(hào)源的內(nèi)阻必需非常高。如在1kHz帶寬，10%精度的條件下，記錄1pA的電流，信號(hào)源內(nèi)阻應(yīng)為2GΩ以上。電壓鉗技術(shù)只能測(cè)量內(nèi)阻通常達(dá)100kΩ～50MΩ的大細(xì)胞的電流，從而不能用常規(guī)的技術(shù)和制備達(dá)到所要求的分辨率。日本多通道膜片鉗專題
