高阻封接問(wèn)題的解決不僅改善了電流記錄性能,還隨之出現(xiàn)了研究通道電流的多種膜片鉗方式。根據(jù)不同的研究目的,可制成不同的膜片構(gòu)型。細(xì)胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細(xì)胞膜表面上,形成高阻封接,在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜,既而通過(guò)微管電極對(duì)膜片進(jìn)行電壓鉗制,分辨測(cè)量膜電流,稱為細(xì)胞貼附膜片。由于不破壞細(xì)胞的完整性,這種方式又稱為細(xì)胞膜上的膜片記錄。此時(shí)跨膜電位由玻管固定電位和細(xì)胞電位決定。因此,為測(cè)定膜片兩側(cè)的電位,需測(cè)定細(xì)胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動(dòng)看,這種形式的膜片是極穩(wěn)定的,因細(xì)胞骨架及有關(guān)代謝過(guò)程是完整的,所受的干擾小。滔博生物TOP-Bright專注基于多種離子通道靶點(diǎn)的化合物體外篩選,服務(wù)于全球藥企的膜片鉗公司,快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果,專業(yè)團(tuán)隊(duì),7*65小時(shí)隨時(shí)人工在線咨詢.了解離子通道的功能以及結(jié)構(gòu)的關(guān)系對(duì)于從分子水平深入探討某些疾病措施等均具有十分重要的理論和實(shí)際意義。德國(guó)單電極膜片鉗離子電流
膜片鉗技術(shù)的建立1.拋光及填充好玻璃管微電極,并將它固定在電極夾持器中。2.通過(guò)一個(gè)與電極夾持器連接的導(dǎo)管給微電極內(nèi)一個(gè)壓力,一直到電極浸入記錄槽溶液中。3.當(dāng)電極浸沒(méi)在溶液中時(shí)給電極一個(gè)測(cè)定脈沖(命令電壓,如5-10ms,10mV)讀出電流,按照歐姆定律計(jì)算電阻。4.通過(guò)膜片鉗放大器的控制鍵將微電極前列的連接電位(junctionpotentials)調(diào)至零位,這種電位差是由于電極內(nèi)填充溶液與浸浴液不同離子成分的遷移造成的。5.用微操縱器將微電極前列在直視下靠近要記錄的細(xì)胞表面,并觀察電流的變化,直至阻抗達(dá)到1GΩ以上形成"干兆封接"6.調(diào)整靜息膜電位到期望的鉗位電壓的水平,使放大器從"搜尋"轉(zhuǎn)到"電壓鉗"時(shí)細(xì)胞不至于鉗位到零。美國(guó)雙電極膜片鉗腦片在膜電位改變時(shí),在電場(chǎng)的作用下,重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉,同時(shí)有電荷移動(dòng),稱為門控電流。
1976年德國(guó)馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí),記錄到ACh的單通道離子電流,從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50cmH2O的負(fù)壓吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal),明顯降低了記錄時(shí)的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。1981年Hamill和Neher等對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù),從而使該技術(shù)更趨完善,具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時(shí)間分辨率。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一書問(wèn)世,奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn),榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。
膜片鉗技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合Neher等**將膜片鉗技術(shù)與Fura2熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合,同時(shí)進(jìn)行如細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞膜離子通道電流及細(xì)胞膜電容等多指標(biāo)變化的快速交替測(cè)定,這樣便可得出同一事件過(guò)程中,多種因素各自的變化情況,進(jìn)而可分析這些變化間的相互關(guān)系。Neher將可光解出鈣離子的鈣螯合物引入膜片鉗技術(shù),進(jìn)而可以定量研究鈣離子濃度與分泌率的關(guān)系及比較大分泌率等指標(biāo)。他又創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測(cè)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)聯(lián)合運(yùn)用的技術(shù)。之后又將光電聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)與碳纖電極電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)首先結(jié)合起來(lái)。這種結(jié)合既能研究分泌機(jī)制,又能鑒別分泌物質(zhì),還能互相彌補(bǔ)各單種方法的不足。Eberwine等于1991年首先將膜片鉗技術(shù)與RT-PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)運(yùn)用,可對(duì)形態(tài)相似而電活動(dòng)不同的結(jié)果作出分子水平的解釋,從此開(kāi)始了膜片鉗與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的時(shí)代∶基因重組技術(shù),膜通道蛋白重建技術(shù)。膜片鉗放大器系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱IPA系統(tǒng))是高度自動(dòng)化的膜片鉗放大器系統(tǒng),所有的功能均通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件完成。
膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成,由于高阻封接使背景噪聲水平降低,相對(duì)地增寬了記錄頻帶范圍,提高了分辨率。另外,它還具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)絕緣性。而小片膜的孤立使對(duì)單個(gè)離子通道進(jìn)行研究成為可能。單通道電流1.典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時(shí)間不等的脈沖樣變化。他有兩個(gè)電導(dǎo)水平,即O和1,分別對(duì)應(yīng)通道的關(guān)閉和開(kāi)效狀態(tài)。2.有的矩形脈沖簇狀發(fā)放時(shí),通道電流不在同一水平,可以明顯觀察到不同數(shù)目離子通道所形成的電流臺(tái)階,從而可推斷出被測(cè)膜片的通道數(shù)目。3.有的通道可記錄到圓滑型和方波形兩種形式。4.有些通道開(kāi)放活動(dòng)是持續(xù)開(kāi)放,中間被閃動(dòng)樣的關(guān)閉所中斷,形成burst開(kāi)放。有些通道開(kāi)放活動(dòng)是簇狀開(kāi)放與短期平靜交替出現(xiàn),形成簇狀發(fā)放串(Cluster)不同的全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)所采用的原理也不完全相同。日本細(xì)胞膜片鉗高阻抗封接
膜片鉗,您研究離子通道功能的得力助手!德國(guó)單電極膜片鉗離子電流
在形成高阻抗封接后,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前,通常要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行參數(shù)補(bǔ)償,以期獲得符合實(shí)際的結(jié)果。需要注意的是,應(yīng)恰當(dāng)設(shè)置放大器的帶寬,例如10kHz,這樣在電流監(jiān)測(cè)端將觀察不到超越此頻帶以外的無(wú)用信息。膜片鉗實(shí)驗(yàn)難度大、技術(shù)要求高,要掌握有關(guān)技術(shù)和方法雖不是很困難的事,但要從一大批的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中,經(jīng)過(guò)處理和分析,得出有意義、有價(jià)值的結(jié)果和結(jié)論,就顯得不那么容易,有許多需要注意和考慮的問(wèn)題,包括減少噪音,避免電極前端的污染,提高封接成功率,具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還需要考慮如何選取記錄模式,為記錄特定離子電流如何選擇電極內(nèi)、外液,如何選擇阻斷劑、激動(dòng)劑,如何進(jìn)行正確的數(shù)據(jù)采集等許多更為復(fù)雜的問(wèn)題,還需在科研實(shí)踐中不斷地探索和解決。滔博生物TOP-Bright專注基于多種離子通道靶點(diǎn)的化合物體外篩選,服務(wù)于全球藥企的膜片鉗公司,快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果,專業(yè)團(tuán)隊(duì),7*56小時(shí)隨時(shí)人工在線咨詢.德國(guó)單電極膜片鉗離子電流