與IdeS不同，在蛋白質(zhì)zhiliao藥物的質(zhì)量控制過程中，詳細分析和識別質(zhì)量屬性非常重要。對于具有柔性連接子的融合蛋白療法，這包括確認連接蛋白的質(zhì)量以及蛋白質(zhì)接頭的質(zhì)量。使用 Genovis的GlySERIAS 的連接子酶切可以通過分離連接的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來幫助這種質(zhì)量控制。然而，連接子中的大量甘氨酸殘基提供了酶的許多潛在消化位點，導(dǎo)致連接子內(nèi)多個位點同時水解。消化的產(chǎn)物通常由連接蛋白的幾種變體組成，并保留不同程度的連接子。雖然觀察到的異質(zhì)性通常不會對蛋白質(zhì)亞基的詳細表征產(chǎn)生負面影響，但有助于直接表征連接子，但有時需要更均勻的消化產(chǎn)物來詳細分析單個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。可用于抗體高階結(jié)構(gòu)（HOS）結(jié)晶和NMR研究、雙抗或多抗的表征、單價結(jié)合研究或完整Fc聚糖分析。河南GlycINATORIdeS蛋白酶抗體酶切

Blinatumomab（一種對 CD19 和 T 細胞標志物 CD3 具有特異性的 BiTE 分子）的研究級生物仿制藥在室溫下用固定化過夜的 Genovis的GlySERIAS 消化。通過LC-MS對消解樣品的直接分析表明，所有三個連接子區(qū)域均被消解，α-CD3 VL和VH鏈洗脫為一個色譜峰，α-CD19 VH和VL鏈作為單獨的峰洗脫。來自連接的 α-CD3 VH 和 α-CD19 VH 結(jié)構(gòu)域的小峰顯示該短連接子未完全消化，表明 GlySERIAS 對短連接子的活性較低。與完整的蛋白質(zhì)分析相比，四個結(jié)構(gòu)域的分離提供了具有單同位素分辨率的高質(zhì)量光譜?？梢杂^察到每個結(jié)構(gòu)域的幾個不同變體，剩余的連接子殘基數(shù)量不同。在色譜分離過程中，α-CD3 VH結(jié)構(gòu)域無法從α-CD19 VH結(jié)構(gòu)域完全基線分離，導(dǎo)致在相關(guān)質(zhì)譜中觀察到一些共洗脫。四個結(jié)構(gòu)域的分離產(chǎn)生了有關(guān)在完整蛋白質(zhì)水平上鑒定的蛋白質(zhì)修飾位置的信息。例如，在完整水平上鑒定的 37 Da 的蛋白質(zhì)修飾被分配給 α-CD3 VH 鏈。此外，240Da 和 320da 的兩個修飾分別被分配給 α-CD3 VL 結(jié)構(gòu)域。后者還含有一個帶有五六個組氨酸殘基的 His 標簽。這些數(shù)據(jù)證明了使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對包含多個柔性連接子蛋白進行質(zhì)量控制的中級工作流程的強大功能。海南FabULOUSIdeS蛋白酶抗體酶切FabRICATOR Magic磁珠化IdeS酶切的自動抗體亞基分析可減少操作人員的時間和樣品處理錯誤的風(fēng)險。

不同于IdeS，Genovis的FabDELLO 是一種蛋白酶，可在鉸鏈上方的單個位點消化人 IgG1，在兩小時內(nèi)產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段，無需還原條件。該酶對具有突變鉸鏈區(qū)域的抗體（如 LALA 突變）具有活性，并啟用中級 LC-MS 來表征具有突變鉸鏈的抗體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。FabDELLO 在鉸鏈上方的單個位點消化人 IgG1 （...KSCDK / THTCPPCP...），生成完整的 Fab 和 Fc 片段。FabDELLO 是一種賴氨酸特異性蛋白酶。單個消化位點是人 IgG1 的三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果，使這種賴氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖，則Fc上暴露的賴氨酸處可能會出現(xiàn)額外的消化位點。FabDELLO在天然條件下具有活性，需要鈣離子的存在。在37°C和pH 7-8.5下獲得良好活性。FabDELLO 是從 Bdellovibrio 細菌克隆而來的，并在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽，分子量為 32 kDa。

為了讓所有實驗室都能同時快速自動消化多種抗體，Genovis的FabRICATORMagIC的設(shè)計具有靈活性，適用于一系列自動化平臺。我們在ThermoScientific?KingFisher?純化系統(tǒng)上優(yōu)化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以轉(zhuǎn)移到其他自動化平臺，如果沒有自動化，在振動臺上也能同樣出色地工作。消解后，將含有處理樣品的深孔板直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動進樣器中進行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進行分析。FabRICATORMagIC與在消解緩沖液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以極大限度地減少自動化系統(tǒng)中可能發(fā)生的純粹壓力。使用KingFisher儀器處理樣品時，樣品制備非常簡單。將樣品、樹脂和緩沖液移液到指定的孔或板中，然后將板放入儀器中。設(shè)計用于FabRICATORMagIC的BindIt?協(xié)議將控制每個步驟的孵育溫度和時間。Genovis還提供了在瓊脂糖樹脂上固定化的酶，在隨時可用的離心柱中，這可以大限度地減少在樣品中殘留的酶。

Genovis的FabRICATOR MagIC自動樣品制備可用于分析和監(jiān)測不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲存過程中的氧化就是這樣一種CQA，可能會影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個問題，對6種mAb的混合物進行強制降解（室溫下3個月），并通過反相LC-MS進行分析。當在完整水平上分析mAb時，可以檢測到mAb5豐度的顯著差異，同時出現(xiàn)許多新的峰。然而，無法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC，mAb5變化的來源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段，可以識別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化，通過形成氧代內(nèi)酯 （+14 Da） 和二氧代內(nèi)酯 （+30 Da） 以及 mAb5 LC （-18 Da） 的琥珀酰亞胺化來揭示。此外，還可檢測到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說明了FabRICATOR MagIC在mAb中級分析中的強大功能，它創(chuàng)建的片段足夠小，可以精確定位特定的修飾，而無需耗時耗費資源的肽圖分析，所有這些都以相對較少的手動操作時間快速完成。FabRICATOR MagIC磁珠含有Ides固定化酶專為自動化平臺（振動臺）而設(shè)計。遼寧FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

Genovis的FabRICATOR （IdeS） 酶已成為一種接受的快速表征單克隆抗體 （mAb） 的分析工具。河南GlycINATORIdeS蛋白酶抗體酶切

與IdeS不同，Genovis的FabULOUS（SpeB）是一種半胱氨酸蛋白酶，可在來自多個不同物種和亞類的IgG的鉸鏈區(qū)域消化，產(chǎn)生Fab和Fc片段。人、小鼠、大鼠、山羊和綿羊的IgG被FabULOUS消化，產(chǎn)生Fab和Fc片段。人IgG1的主要消化位點是......KTHT...例如，制備的Fab片段可用于親和力研究、Fab糖基化研究和結(jié)構(gòu)研究。對來自多個物種和亞類的IgG有活性–上鉸鏈區(qū)域的消化物；快速-在一小時內(nèi)生成Fab和Fc片段；有效消化小鼠IgG1。FabULOUS來源于化膿性鏈球菌，在大腸桿菌中表達。FabULOUS的分子量為29kDa，該酶含有His標簽。河南GlycINATORIdeS蛋白酶抗體酶切