Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定量分析可以分為定量和相對定量兩種。定量指的是我們想知道某個基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少？定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。而相對定量是指我們想知道某一個基因在不同樣品中表達(dá)量的差異，其目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如研究項目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本，記為已處理樣本和未處理樣本，通?？梢詫⑽刺幚順颖局付榛鶞?zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，用已處理樣本的定量結(jié)果除以未處理樣本的定量結(jié)果，就可以計算每個已處理樣本的基因含量相對于未處理樣本的百分比。相對定量可以應(yīng)用于差異顯示結(jié)果驗證、基因芯片結(jié)果驗證、siRNA效果確認(rèn)、mRNA表達(dá)量分析等等。實時熒光定量PCR實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度。寧波血液RT-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達(dá)2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。寧波血液RT-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準(zhǔn)確的方法。

Real-time PCR：Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，普遍用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。實時熒光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和定量。

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環(huán)的熒光信號，同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線。閾值（threshold)：自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達(dá)差異,一般是2-△△Ct?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。Real-time PCR探針法適用于擴增序列專一的體系的檢測。

Real-time PCR：對擴增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析。寧波血液RT-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針。寧波血液RT-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，之后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。寧波血液RT-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

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