Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等；2.基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA晶片或差顯結(jié)果的確證；3.基因分型：例如SNP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen（螢光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針?lè)ǎ?shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度。南京細(xì)胞熒光定量PCR方案

Real-time PCR雙熒光標(biāo)記探針設(shè)計(jì)原則：具體的其他要求可以具體聯(lián)系設(shè)計(jì)公司，拿到合成好的引物，需要先確認(rèn)引物的性能。可以用這對(duì)引物先擴(kuò)增梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品介紹見(jiàn)后續(xù)內(nèi)容）。由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品的加量和其對(duì)應(yīng)的Ct值，描繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這里要注意根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的參數(shù)是非常重要的。引物性能確認(rèn)：1.決定系數(shù)R2大于0.98，越接近于1，結(jié)果越可靠。2.擴(kuò)增效率一般要求在0.8-1.2，越接近于1，越好。3.檢測(cè)的靈敏度，必須確認(rèn)，通常要求35個(gè)循環(huán)以?xún)?nèi)，一般可以得到比較好的定量結(jié)果，30個(gè)循環(huán)以?xún)?nèi)，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生。4.NTC是必須要確認(rèn)的，通常要求30個(gè)循環(huán)內(nèi)沒(méi)有引物二聚體產(chǎn)生。寧波實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究方案在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱(chēng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過(guò)這項(xiàng)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，而不必依賴(lài)大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡(jiǎn)單，廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段，這個(gè)概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成，稱(chēng)為熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

Real-time PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準(zhǔn)確的方法。如果用于RNA檢測(cè)，這被稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即（Real-timeRT-PCR）是實(shí)時(shí)PCR法，它是指對(duì)DNA或經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的放大過(guò)程，在擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)期就測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長(zhǎng)期測(cè)量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關(guān)性，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Real-time PCR的基本目標(biāo)是精確測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過(guò)監(jiān)測(cè)CT值而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始目標(biāo)基因的含量定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法較大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺(tái)期或叫飽和期后定量的較大誤差，實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術(shù)不單單實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。自誕生后Real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡(jiǎn)單的增擴(kuò)到整個(gè)PCR過(guò)程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對(duì)識(shí)別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個(gè)循環(huán)增擴(kuò)曲線的增長(zhǎng)。事實(shí)并非如此，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線。主要是因?yàn)镾DS軟件采用整個(gè)平臺(tái)較終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)循環(huán)。對(duì)某些設(shè)備來(lái)說(shuō)，必須向分析軟件提供實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實(shí)時(shí)跟蹤每個(gè)加樣口的增擴(kuò)曲線，同時(shí)顯示在電腦屏幕上。通過(guò)使用本產(chǎn)品，可以在更短的時(shí)間內(nèi)，簡(jiǎn)便、低成本地進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。溫州細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟

Real-time PCR反是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理。南京細(xì)胞熒光定量PCR方案

引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子，不能在一個(gè)外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來(lái)擴(kuò)增的，如果有DNA污染的話，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）。2，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度，方便于以后同時(shí)擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開(kāi)做，浪費(fèi)模板，浪費(fèi)管家基因，所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)有利。南京細(xì)胞熒光定量PCR方案

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