聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。溫州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。南通實(shí)時(shí)數(shù)字PCR設(shè)計(jì)公司重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學(xué)中得到較廣應(yīng)用：遺傳指紋以其辨別力的形式，可以從世界上所有人群中獨(dú)特地區(qū)分任何一個(gè)人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場(chǎng)，和比較的從嫌疑人那里，或者從DNA資料庫(kù)早期的證據(jù)或罪犯。這些測(cè)試的簡(jiǎn)單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗(yàn)，確認(rèn)或免責(zé)很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定，在親子鑒定中，一個(gè)人和他的近親相匹配。可以測(cè)試未知人類遺骸的DNA，并與可能的父母、兄弟姐妹或兒童進(jìn)行比較。類似的測(cè)試可以用來(lái)確認(rèn)被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實(shí)際生父也可以被確認(rèn)(或排除)。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。檢測(cè)：PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：定量PCR允許實(shí)時(shí)定量和檢測(cè)特定的DNA序列，因?yàn)樗诤铣蛇^(guò)程中測(cè)量濃度。有兩種方法可以同時(shí)檢測(cè)和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針。只有在探針與其互補(bǔ)DNA雜交后，才能使用這些方法檢測(cè)DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實(shí)時(shí)PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA。通過(guò)這種組合技術(shù)，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進(jìn)一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點(diǎn)出錯(cuò)的可能性，增加了檢測(cè)與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會(huì)。實(shí)驗(yàn)室使用RT-qPCR來(lái)靈敏地測(cè)量基因調(diào)控。聚合酶鏈反應(yīng)很容易理解和使用，并迅速產(chǎn)生結(jié)果。廈門實(shí)時(shí)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強(qiáng)大和實(shí)用的研究工具。溫州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)公司

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。溫州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)公司

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