實時定量PCR的系統(tǒng)構成及工作原理：熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構成。設備由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正?；幚韥韽浹a背景熒光的差異。正?；罂梢栽O定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。序列間特異性聚合酶鏈反應是一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應方法。徐州微量RT-PCR檢測技術原理及步驟

聚合酶鏈反應允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應為這些技術提供了大量的純DNA，有時是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進行分析。脫氧核糖核酸測序的任務也可以通過聚合酶鏈反應來輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對擴增技術的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應有許多應用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點的)插入片段。徐州微量RT-PCR檢測技術原理及步驟聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。

Real-time PCR：實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即（Real-timeRT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴增的指數(shù)增長期就測量擴增產(chǎn)物，因為擴增指數(shù)增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現(xiàn)定量檢測。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法較大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術不單單實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面有著重要的意義。

PCR的反應條件：dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。流聚合酶鏈反應：一種偽等溫PCR方法。

聚合酶鏈式反應：1976年，中國科學家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。徐州微量RT-PCR檢測技術原理及步驟

在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。徐州微量RT-PCR檢測技術原理及步驟

Real-time PCR鏈反應注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構以及目標DNA起始的數(shù)量有關。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應的循環(huán)數(shù)，均應通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。徐州微量RT-PCR檢測技術原理及步驟

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