尋找肝臟疾病的新型分子標(biāo)志物一直是研究熱點，也是難點。不同肝臟疾病中，細(xì)胞分泌的外泌體所攜帶的核酸和蛋白組分之間存在差異。這些不同生理狀態(tài)下外泌體所攜帶的特異性蛋白分子、miRNA等，是潛在的分子診斷和預(yù)后標(biāo)志物。肝細(xì)胞患者中，血清外泌體miR-21、-18a、-221、-222和miR-224明顯上升，miR-101、-106b、-122和miR-195明顯下降。而HCC患者肝移植復(fù)發(fā)后，血清外泌體miR-718水平明顯下降。除外泌體外，微泡也有可能作為新型標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)HCV患病者中CD4+和CD8+T細(xì)胞來源的微泡含量上升；而肝臟干細(xì)胞分泌的微泡中多種miRNAs上調(diào)。外泌體是內(nèi)源性和質(zhì)膜起源的不同類型的膜囊泡。umibio公司

目前市面上開發(fā)的外泌體提取試劑盒，是根據(jù)外泌體表面由類似于細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層具有一定疏水性這一特性，用試劑捆綁水分子，從而可通過常規(guī)離心收集沉淀獲取外泌體。這種快速提取外泌體的方法雖簡便快捷、樣本需求少、對設(shè)備要求低，但與差速離心方法類似，其分離得到的沉淀包含其他細(xì)胞分泌的囊泡，且血清中含有大量血清蛋白分子，成分復(fù)雜，很可能摻雜一些未知的疏水大分子物質(zhì)。Sabapatha等曾根據(jù)來源于胎盤的外泌體表面特異表達(dá)這一特性，使用耦合到磁珠的抗抗體，采用磁珠分選方法分離血漿中胎盤來源外泌體。此法可以提取的胎盤外泌體量少，不適用于大規(guī)模提取制備，且免疫磁珠價格昂貴，不利于提取技術(shù)的普及。umibio公司細(xì)胞外囊泡（EVs）表示了細(xì)胞間通訊的一個重要模式。

多項研究表明中流細(xì)胞來源的外泌體能夠抑制免疫相關(guān)的信號通路、阻礙機(jī)體對中流的免疫響應(yīng)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞、乳腺ai和肺ai細(xì)胞會產(chǎn)生攜帶程序性死亡分子1的配體(programmedcelldeath1ligand1，PD-L1)的外泌體，此類外泌體在血液中循環(huán)，通過表面PD-L1與T細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致T細(xì)胞在到達(dá)中流細(xì)胞之前即受到抑制，達(dá)到遠(yuǎn)程干擾免疫細(xì)胞活性的效果。中流來源的外泌體能夠抑制骨髓來源的抑制性細(xì)胞(該細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)、巨噬細(xì)胞和(或)粒細(xì)胞的前體，具有抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力)對中流的免疫監(jiān)督。中流細(xì)胞來源的外泌體與巨噬細(xì)胞共孵育后，其內(nèi)的miRNA-301a通過下調(diào)抑ai基因PTEN)，激huoPI3Kγ(phosphoinositide3-kinaseγ)信號分子，使巨噬細(xì)胞被“馴化”成為能參與抗yan反應(yīng)、血管生成以及促進(jìn)中流生長轉(zhuǎn)移的M2型巨噬細(xì)胞。

利用蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)可以對外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。其中蛋白免疫印跡是外泌體的經(jīng)典表征手段之一，操作時往往需要細(xì)胞裂解液作為陰性對照。常用的外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白質(zhì)CD63、CD81、CD9、中流易感基因101蛋白(TSG101)、水通道蛋白2(AQP2，尿液中)和凋亡誘導(dǎo)因子6相互作用蛋白(Alix)等，內(nèi)參蛋白質(zhì)可以是肌動蛋白(βActin)或甘油醛－3-磷酸脫氫酶，陰性對照蛋白可以是阻抑素(PHB，線粒體標(biāo)志蛋白)或鈣聯(lián)結(jié)蛋白Calnexin。在酶聯(lián)免疫吸附析法中，外泌體裂解液通過固載有抗體的固相基質(zhì)，隨后與檢測抗體共孵育。兩種方法均存在操作繁瑣、耗時長的問題，相比較而言，酶聯(lián)免疫吸附分析法比蛋白質(zhì)免疫印跡法更加快速，適用于高通量分析。外泌體膜蛋白可以與靶細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，進(jìn)而喚醒靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的信號通路。

外泌體的提取方法：免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實驗。PS親和法，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。PS法可提取相當(dāng)高純度的外泌體。色譜法，這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不寬泛。外泌體是一種由活細(xì)胞分泌的，直徑約為40～160nm的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的生物活性囊泡。外泌體提取試劑盒生產(chǎn)廠家

外泌體不只可作為疾病診斷的生物標(biāo)志，而且可作為天然的藥物傳遞載體。umibio公司

一類外泌體中常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合，有文獻(xiàn)報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)于早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)于晚期的核內(nèi)體。現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易?、熱休克蛋白家族。其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類的酶、核糖體蛋白（RPS3）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（黑色素瘤分化相關(guān)因子,ARF1,CDC42,人類紅細(xì)胞膜整合蛋白,SLC9A3R1）、粘附因子、細(xì)胞骨架蛋白以及泛素等。umibio公司