通過對(duì)28例前列腺ai癥患者和19例正常人尿液外泌體中的miRNA進(jìn)行深度測序分析,發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺ai患者組明顯下調(diào),表明尿液外泌體中的特異性miRNA可能作為前列腺ai的新型生物標(biāo)志物。Khurana等[100]將研究對(duì)象由miRNAs擴(kuò)大至多種類型RNA,通過對(duì)慢性腎病患者尿液外泌體中各類RNA進(jìn)行系統(tǒng)研究,在慢性腎病患者組中識(shí)別出30種明顯差異的lncRNAs,表明尿液外泌體中的lncRNAs具有作為慢性腎病早期診斷標(biāo)志物的潛力。Skotland等的研究則表明尿液外泌體中的脂質(zhì)能夠作為前列腺ai的新型標(biāo)志物,3種脂質(zhì)標(biāo)志物結(jié)合使用能夠有效提高對(duì)前列腺ai的診斷靈敏度(93%)和特異性(100%)。外泌體在組織修復(fù)領(lǐng)域均起著重要的作用,并且可以作為很好靶向給藥系統(tǒng)。外泌體的使用方法
Buller等利用miR-146b的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞,使其分泌的外泌體負(fù)載miR-146b,并將外泌體注射至移植到小鼠體內(nèi)的GBM處。結(jié)果表明,這種利用外泌體運(yùn)輸miRNA進(jìn)行zhiliao的方法可以有效抑制中流的生長。對(duì)于GBM類腦部中流,體內(nèi)zhiliao不同于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),更需考慮腦部組織微環(huán)境對(duì)藥物的影響,外泌體可運(yùn)輸miRNA并不破壞其在腦部中流組織處的原本功效。然而,至今還沒有利用外泌體載藥經(jīng)靜脈注射zhiliaoGBM的報(bào)道,這主要是由于跨越血腦屏障(BBB)仍然是外泌體進(jìn)行腦部中流zhiliao需要解決的難題。盡管如此,Wood等報(bào)道的在進(jìn)行阿茲茨海默病zhiliao時(shí)利用對(duì)腦部神經(jīng)元特異性肽RVG靶向的外泌體穿過BBB的研究顯示了經(jīng)靶向修飾的外泌體具備穿過BBB的潛力,因此外泌體載藥zhiliao具有廣闊的前景。研究所外泌體提取試劑盒方法近些年關(guān)于外泌體研究很普遍。
外泌體的形成始于細(xì)胞內(nèi)陷,成熟于多囊泡胞內(nèi)體,終于膜融合。細(xì)胞通過內(nèi)吞作用產(chǎn)生小囊泡,小囊泡融合形成早期胞內(nèi)體(earlyendosome),在多個(gè)蛋白的協(xié)同調(diào)控下,早期胞內(nèi)體出芽形成含有多個(gè)腔內(nèi)小囊泡的多泡體(multivesicularbodies,MVB),這個(gè)過程中這些腔內(nèi)小囊泡(intraluminalvesicles,ILVs)會(huì)裝載各種核酸和蛋白質(zhì)等分子,泡內(nèi)體較后在GTPase家族中RAB酶的調(diào)節(jié)下與細(xì)胞膜融合。隨后,這些小囊泡會(huì)被釋放到細(xì)胞外,稱為外泌體。外泌體是通過細(xì)胞內(nèi)吞細(xì)胞膜融合主動(dòng)排除的物質(zhì),大小均勻,而微泡是由細(xì)胞直接出芽脫落生成,大小不均一。
妊娠期間胎盤可釋放外泌體到全身循環(huán)系統(tǒng),參與妊娠期間母胎界面的免疫調(diào)節(jié)、子宮螺旋動(dòng)脈重塑和胎盤屏障的形成等重要事件調(diào)控,在正常妊娠過程維持中發(fā)揮重要作用。而很多妊娠并發(fā)癥,如子癇前期等胎盤功能紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生,很可能與胎盤來源外泌體異常密切相關(guān)。目前外泌體分離方法主要包括:多步差速離心、蔗糖密度梯度離心、試劑盒沉淀、免疫磁珠分選、色譜法、過濾離心等方法。其中,多步差速離心是制備外泌體的經(jīng)典方法,該方法是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)差速離心將其分離出來,然而妊娠期母血清中除含有胎盤組織釋放的外泌體,還包括許多其他種類細(xì)胞釋放的外泌體,如樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,且血清中可能還存在一些大小類似的物質(zhì)混雜其中,這些因素都會(huì)影響胎盤來源外泌體的分離純化。外泌體具有良好的生物兼容性、穩(wěn)定性和內(nèi)在靶向性,使其在藥物遞送方向大有潛力。
為了解決外泌體實(shí)驗(yàn)遇到的上述的各種問題,Wako研發(fā)出MagCapture?外泌體提取試劑盒PS(MagCapture?ExosomeIsolationKitPS)提取高純度細(xì)胞外囊泡。外泌體膜含有分泌細(xì)胞源的蛋白和脂質(zhì),眾所周知磷脂酰絲氨酸(PS)在活細(xì)胞通過翻轉(zhuǎn)酶作用導(dǎo)向細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),暴露在外泌體膜外側(cè)3)。另外,T-cellimmunoglobulindomainandmucindomain-containingprotein4(Tim4通過巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的吞噬受體)蛋白通過細(xì)胞外域IgV域與含有鈣離子的PS結(jié)合4)?;谏鲜鲋R(shí),我們利用Tim4固化磁珠,在鈣離子存在下捕捉培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體,再添加螯合劑洗脫外泌體,這種外泌體純化方法是和金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)華山教授共同開發(fā),并取得了成功。5)這是迄今為止取代黃金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法的新型外泌體純化方法。外泌體與各種疾病的相關(guān)性被檢測出,特別是血液中釋放的病細(xì)胞來源的外泌體。外泌體的使用方法
高濃度集聚誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的TNF-α,可使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎惡化。外泌體的使用方法
除了siRNA和miRNA,mRNA也可以作為“貨物”被外泌體運(yùn)輸。研究表明,在移植了人肺中流的小鼠模型的血液和唾液中分離出來的外泌體含有中流細(xì)胞特異性的mRNA,而被愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)感ran的細(xì)胞分泌的外泌體中也含有EBV的潛伏期mRNA。因而,外泌體的這種運(yùn)載mRNA的能力引起了中流研究者們的注意。近期,Saydam等率先報(bào)道了利用多泡體(含外泌體)負(fù)載mRNA/蛋白進(jìn)行中流zhiliao的研究。研究者們利用脂質(zhì)體2000或病毒載體對(duì)HEK-293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使其分泌的多泡體含有mRNA/蛋白(CD-UPRTEGFP,其中CD:胞嘧啶脫氨酶;UPRT:尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶;EGFP:增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)。將此多泡體注射至小鼠的神經(jīng)鞘瘤處,并輔助注射5氟尿嘧啶(5-FC),神經(jīng)鞘瘤的增長被明顯抑制。外泌體的使用方法
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