常規(guī)生物學(xué)實驗中,實時定量PCR技術(shù)(RT-PCR)普遍用于microRNA的檢測實踐中,但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù)。微滴式數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR),又成為“油包水PCR”,在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進(jìn)行微滴化處理,即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后,逐個對每個微滴進(jìn)行檢測,有熒光信號的微滴判讀為1,沒有熒光信號的微滴判讀為0,根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體為細(xì)胞療法中的不同合成分子和生物分子的遞送提供了廣闊的前景和嶄新的診療領(lǐng)域。血液外泌體芯片
被特定部位的細(xì)胞獲取的瘤子外泌體可為腫細(xì)胞的轉(zhuǎn)移準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。用肺轉(zhuǎn)傾向的腫細(xì)胞細(xì)胞來源的外泌體處理小鼠后可使骨轉(zhuǎn)傾向的腫細(xì)胞細(xì)胞重新定向。外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同部位傾向性的腫細(xì)胞細(xì)胞來源的外泌體具有不同的整合素(integrin)表達(dá)譜,整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)有關(guān),而整合素αvβ5與肝轉(zhuǎn)有關(guān)。敲低整合素α6β4和αvβ5可減少外泌體被靶部位細(xì)胞獲取,進(jìn)而分別降低了肺和肝的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體整合素被細(xì)胞獲取后活躍了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表達(dá)。通過臨床數(shù)據(jù)分析顯示外泌體整合素可作為預(yù)測腫細(xì)胞轉(zhuǎn)移的部位傾向性的診斷指標(biāo)。外泌體的提取的方式:PS親和法。血漿外泌體提取試劑盒公司外泌體在免疫調(diào)控、肉瘤轉(zhuǎn)移和血管生成以及生物標(biāo)志物等領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用。
外泌體病毒傳染:外泌體可以限制或促進(jìn)病毒傳染。如IFNα或APOBEC3G等外泌體載體可通過限制病毒復(fù)制或增強抗病毒免疫來阻止傳染。病毒也可以劫持外泌體的生物發(fā)生機制來促進(jìn)病毒的傳播。外泌體可以作為一個假包膜,通過四聚體蛋白(CD81,CD9)和PtSer相互作用增強病毒進(jìn)入受體細(xì)胞,并幫助逃避抗病毒免疫。病毒組分(蛋白質(zhì)和miRNA)的共轉(zhuǎn)運也可能增強傳染性。外泌體介導(dǎo)的病毒轉(zhuǎn)移可能參與了病毒的遺傳協(xié)同和多重傳染.(CMV,巨細(xì)胞病毒;HSV-1,1型皰疹病毒)。
外泌體的臨床應(yīng)用:間充質(zhì)干細(xì)胞是目前較普遍使用的細(xì)胞類型,它具有自我更新,多向分化、分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡體、免疫調(diào)節(jié)、來源普遍等特點,在流感病毒的臨床診療中取得了良好的成果。間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與間充質(zhì)干細(xì)胞有著相似的功能,包括修復(fù)與再生組織、阻止炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)機體免疫,但外泌體相對于間充質(zhì)干細(xì)胞又有許多優(yōu)勢。首先,間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體更穩(wěn)定,更好保存,易于管理和控制,可以人為改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量。其次,它們沒有活細(xì)胞,不會像間充質(zhì)干細(xì)胞那樣可能會過多增殖而放大療效或者病變導(dǎo)致疾病加重;另外,它有可能避免某些針對間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控問題,間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體有代替間充質(zhì)干細(xì)胞的趨勢。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預(yù)后分析。
外泌體的提取分離方法:1、超濾離心:由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體,大于一般蛋白質(zhì),利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進(jìn)行選擇性分離,便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效,且不影響外泌體的生物活性,是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。2、磁珠免疫法:外泌體表面有其特異性標(biāo)記物(如CD63、CD9蛋白),用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合,即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點,但是效率低,外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響,不利于下游實驗,難以普遍普及。外泌體的細(xì)胞源:人體中幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體。細(xì)胞外泌體提取試劑盒方法
免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一,其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合。血液外泌體芯片
外泌體的來源與特征:外泌體是一種存在于細(xì)胞外的多囊泡體,通過細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成,其大小均一,直徑為40-100nm,密度為1.10-1.18g/mL。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腫細(xì)胞細(xì)胞等多種類型細(xì)胞主動分泌釋放。外泌體內(nèi)主要含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等,可作為疾病診斷標(biāo)記物、調(diào)控靶細(xì)胞功能、參與細(xì)胞生物學(xué)活動等。例如:含有miR-140-5p的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(SMSC-Exo影響軟骨組織再生;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-196a可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨再生。外泌體顯示出了在診療各種疾?。ㄈ缧募〔『蜕窠?jīng)?。┓矫娴臐摿?。血液外泌體芯片
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