流式細胞技術(shù)是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法，其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升。將外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、CD81等相應(yīng)抗體進行標(biāo)記，可用流式細胞儀檢測到陽性表達，從而實現(xiàn)對外泌體的定量。但流式細胞技術(shù)檢測時需要單顆粒懸浮液，當(dāng)外泌體濃度高或分離過程中發(fā)生外泌體囊泡聚集時將導(dǎo)致一次觀察到多個顆粒，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此，為了通過流式細胞儀觀察，需要將外泌體通過免疫捕獲或共價結(jié)合固定在磁珠表面上，從而便于將外泌體囊泡暴露于已知或者預(yù)期在外泌體表面表達的抗原的熒光偶聯(lián)抗體中。在流式細胞術(shù)之前，可在落射熒光顯微鏡（EPI）下觀察與磁珠和熒光抗體偶聯(lián)的外泌體囊泡。當(dāng)樣品通過流式細胞儀時采集熒光信號，不只可以對外泌體進行高通量分析，還可以基于抗原表達對外泌體進行定量或分類。外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml。外泌體冷藏還是冷凍

外泌體中常見的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體。現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。外泌體的提取的方式：超速離心法。尿外泌體的生物學(xué)特征是什么近年來，隨著外泌體研究的不斷深入，它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域。

尺寸排阻色譜法（SEC）根據(jù)大小來分離樣本。該技術(shù)應(yīng)用了一個裝有多孔聚合物珠的色譜柱，該聚合物珠包含多個孔和通道，分子根據(jù)其直徑穿過。半徑小的分子穿過柱子的孔遷移需要較長的時間，而大分子則較早地從柱子上洗脫下來。SEC可精確分離大分子和小分子。與離心分離方法相比，SEC分離的外泌體不受剪切力的影響，剪切力可能會改變囊泡的結(jié)構(gòu)。此方法分離到的外泌體純度較高，在電鏡下大小均一，但是獲取量少，所需設(shè)備特殊。此外，SEC方法與超濾相結(jié)合已被用于尿液來源的外泌體的分離和分析。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上，將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中，由于抗體-抗原相互作用，表達抗原的外泌體將被捕獲固定在板上。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉，并使用另一種抗體檢測固定的外泌體。ELISA已用于從尿液、血漿和血清中分離出外泌體，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)液（已知外泌體的量）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時，甚至可以進行定量。但是，此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進行預(yù)處理。同樣，流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度。外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實現(xiàn)的。

細胞攝取診療性外泌體：從樹突狀細胞、成纖維細胞和間充質(zhì)細胞中分離出的診療性外泌體可對靶細胞產(chǎn)生特定的作用，包括新抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞。診療性外泌體對靶細胞的影響可能是通過不同的進入或相互作用機制來控制的。完整的外泌體的進入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞飲作用。外泌體內(nèi)容物的進入或外泌體信號的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細胞內(nèi)信號或融合，從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細胞質(zhì)中。近年來，隨著外泌體研究的不斷深入，它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域。外泌體發(fā)揮功能方式：細胞-細胞之間的通訊，譬如抗原遞呈，這是發(fā)揮功能的主要方式。外泌體與細胞因子風(fēng)暴

疾病的進展和對診療的反應(yīng)可以通過外泌體的多組分分析來確定。外泌體冷藏還是冷凍

外泌體的提取分離方法：1、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。外泌體冷藏還是冷凍

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