常規(guī)生物學(xué)實驗中,實時定量PCR技術(shù)(RT-PCR)普遍用于microRNA的檢測實踐中,但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù)。微滴式數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR),又成為“油包水PCR”,在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進(jìn)行微滴化處理,即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后,逐個對每個微滴進(jìn)行檢測,有熒光信號的微滴判讀為1,沒有熒光信號的微滴判讀為0,根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體的膜同細(xì)胞一樣,是磷脂雙分子層。外泌體提取試劑盒價格
外泌體較有用的特性之一是它們穿過屏障(如細(xì)胞質(zhì)膜和血/腦屏障)的能力。這使它們成為理想的診療傳遞分子。外泌體由于其天然的材料運輸特性,固有的長期循環(huán)能力和出色的生物相容性而具有比較大的潛力成為藥物遞送載體,其適合于遞送各種化學(xué)物質(zhì),蛋白質(zhì),核酸和基因診療劑。(1)外泌體作為小分子的藥物傳遞載體:關(guān)于外泌體遞送姜黃素,多巴胺,PTX和DOX等化學(xué)診療藥物的報道已有充分文獻(xiàn)記載。(2)外泌體作為蛋白質(zhì)的藥物遞送載體:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體可遞送多種蛋白質(zhì),例如酶,細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)和跨膜蛋白質(zhì)。(3)外泌體作為核酸的藥物遞送載體:研究表明,外泌體天然的可以攜帶遺傳(例如miRNA,siRNA)到靶細(xì)胞中,從而在生物學(xué)和致病過程中誘導(dǎo)遺傳修飾。外泌體的這些特征已成為涉及遺傳療法和使用外泌體進(jìn)行研究的主要策略。遼寧CD81外泌體慢病毒包裝外泌體的提取的方式:色譜法。
外泌體提取在短時間(一周之內(nèi))使用,可以放在4度保存,如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進(jìn)行分裝,分別放在-20度或-80度。外泌體檢測方法:外泌體分離之后,需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物,多角度進(jìn)行鑒定。l、透射電鏡鑒定法:簡稱TEM,適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察,即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。2、納米顆粒追蹤分析法:簡稱NTA,該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快,檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
細(xì)胞攝取診療性外泌體:從樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中分離出的診療性外泌體可對靶細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用,包括新抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞。診療性外泌體對靶細(xì)胞的影響可能是通過不同的進(jìn)入或相互作用機制來控制的。完整的外泌體的進(jìn)入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞飲作用。外泌體內(nèi)容物的進(jìn)入或外泌體信號的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號或融合,從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細(xì)胞質(zhì)中。近年來,隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域。外泌體存在于組織樣本中,如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。
外泌體的提取、純化和鑒定:每一個外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體,并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達(dá)到分離效果。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實現(xiàn)的。近來的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用,如免疫中抗原呈遞、瘤子的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能,可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),能比較好的保護(hù)其包被的物質(zhì),且能靶向特定細(xì)胞或組織,因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng)。需要開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量可控的外泌體并快速純化外泌體的技術(shù)和策略。外泌體超濾濃縮
外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。外泌體提取試劑盒價格
外泌體的來源與特征:外泌體是一種存在于細(xì)胞外的多囊泡體,通過細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成,其大小均一,直徑為40-100nm,密度為1.10-1.18g/mL。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肉瘤細(xì)胞等多種類型細(xì)胞主動分泌釋放。外泌體內(nèi)主要含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等,可作為疾病診斷標(biāo)記物、調(diào)控靶細(xì)胞功能、參與細(xì)胞生物學(xué)活動等。例如:含有miR-140-5p的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(SMSC-Exo影響軟骨組織再生;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體攜帶的miR-196a可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)大鼠顱骨缺損的骨再生。外泌體提取試劑盒價格
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