無血清細(xì)胞凍存液使用方法：選擇凍存處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞有助于提高復(fù)蘇細(xì)胞存活率。1）按照常用方法收集懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞于試管中。2）按照培養(yǎng)細(xì)胞密度和所用細(xì)胞凍存管的尺寸計(jì)算所需凍存細(xì)胞數(shù)。（參考：5×105至5×106cells/ml）。3）取相當(dāng)于所需細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸浮液量，置于離心管中，離心收集培養(yǎng)細(xì)胞（參考離心條件：1,000~2,000rpm，4℃，3~5min）。移去離心管中的上清液。4）加入適量的無血清型細(xì)胞凍存液于離心管中，使細(xì)胞濃度為5×105至5×106cells/ml。緩慢地混合均勻，制成細(xì)胞混合液。5）將離心管中的細(xì)胞混合液分裝于已標(biāo)示完全的冷凍保存管中。6）直接將含細(xì)胞混合液的凍存管放入-80℃以下冰箱，長(zhǎng)期冷凍保存。無血清凍存液注意事項(xiàng)：若需長(zhǎng)期凍存細(xì)胞，請(qǐng)轉(zhuǎn)移至液氮罐中貯存。唐山無血清細(xì)胞凍存液供應(yīng)商

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以較大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞凍存是細(xì)胞培養(yǎng)、引種、保種和保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要技術(shù)手段。在細(xì)胞建株和建系中，及時(shí)凍存原始細(xì)胞是十分重要的。在雜交瘤單克隆抗體的制備過程中，雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞的凍存保種常常是必不可少的實(shí)驗(yàn)操作。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系或穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能因細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失或遺傳變異等等導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛肮ΡM棄。上海無血清細(xì)胞凍存液供應(yīng)商可以在冰晶形成之前，優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞外的水分子。

細(xì)胞凍存秘籍：程序1.凍存前檢查凍存前，細(xì)胞應(yīng)處于指數(shù)生長(zhǎng)期，確保細(xì)胞處于健康狀態(tài)。理想情況下，應(yīng)在收獲細(xì)胞前24小時(shí)更換培養(yǎng)基。建議對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行微生物污染物，特別是支原體的檢測(cè)，并通過適當(dāng)?shù)姆椒?，如STR分析確定其身份。如果在培養(yǎng)過程中使用物品，那么建議在冷凍前1到2周不使用物品，這樣如果出現(xiàn)污染，可以更容易地發(fā)現(xiàn)。2.收集細(xì)胞通常，您可以使用常規(guī)細(xì)胞傳代的實(shí)驗(yàn)程序來收獲細(xì)胞。細(xì)胞收獲期間盡可能溫和操作。本程序推薦的試劑量是針對(duì)為75平方厘米（T-75）培養(yǎng)瓶；若使用其他培養(yǎng)容器，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整所用試劑量。A.使用無菌吸管，取出并丟棄培養(yǎng)基。請(qǐng)妥善處置與細(xì)胞接觸的任何材料和溶液。B.用5到10mlCMF-PBS沖洗細(xì)胞，去除所有痕量的血清。C.加入3到5ml的胰酶（在CMF-PBS中），37℃孵育。預(yù)熱酶溶液通常會(huì)縮短處理時(shí)間。

細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)：離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。無血清凍存液注意事項(xiàng)：請(qǐng)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行凍存。

細(xì)胞凍存的基本原理：細(xì)胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時(shí)會(huì)集體不工作，低溫貯藏的目的是通過較低溫使細(xì)胞代謝活動(dòng)近乎停止。細(xì)胞因此進(jìn)入休眠狀態(tài)，使細(xì)胞“不會(huì)老”，所以可以長(zhǎng)期保存。因?yàn)閮鋈谶^程對(duì)所有細(xì)胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發(fā)出有效的技術(shù)來防止細(xì)胞死亡和損傷。低溫保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞內(nèi)冰凍影響，目前多采用DMSO，甘油，乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護(hù)劑。它們的作用機(jī)制包括：自由進(jìn)入細(xì)胞，取代水，使冰點(diǎn)下降，充當(dāng)鹽的二次溶劑，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性。無血清快速細(xì)胞凍存液：減少各類病毒、霉菌和支原體等的污染，確保凍存細(xì)胞安全。上海無血清細(xì)胞凍存液供應(yīng)商

在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。唐山無血清細(xì)胞凍存液供應(yīng)商

細(xì)胞凍存，我們應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)：1、凍存液比例一般是培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1；動(dòng)物種屬的原代細(xì)胞凍存液可采用的比例是培養(yǎng)基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細(xì)胞再加入DMSO，盡管如此，原代細(xì)胞的復(fù)蘇成活率還是很低。2、有文獻(xiàn)表明，細(xì)胞以l℃/min的速度冷凍存活率較髙，因?yàn)檫@一速度可以很好的控制細(xì)胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生。我們實(shí)際操作不可能將速度控制的這么精確，目前慣用的就是4℃30min、-20℃1h30min、-80℃2h后轉(zhuǎn)入液氮中。唐山無血清細(xì)胞凍存液供應(yīng)商