細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介：轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是，細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.細(xì)胞污染細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無(wú)菌。而現(xiàn)在市場(chǎng)上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到較全無(wú)菌。毛博這里再貢獻(xiàn)一個(gè)獨(dú)門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的較后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。2.質(zhì)粒不行轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。這個(gè)時(shí)候，就應(yīng)該對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。南京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測(cè)：基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率。可以使用報(bào)告基因來(lái)確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測(cè)，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤?jiǎn)單的非同位素方法檢測(cè)b-gal的表達(dá)以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步驟，可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.不注意細(xì)節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來(lái)，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié)，但是，如果不注意的話，也會(huì)造成轉(zhuǎn)染效率低下。2.細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞狀態(tài)不好，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。如果是貼壁細(xì)胞的話，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話，應(yīng)該是6X105個(gè)/孔（24孔板），一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次。轉(zhuǎn)染的整個(gè)過程都不應(yīng)該有物品。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實(shí)驗(yàn)前做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，比如：HeLa，293，CHO，COS7，MCF－7，HepG2等細(xì)胞，是否加血清，對(duì)不同的細(xì)胞是有不同的影響的，有些細(xì)胞是可以有血清的，有些加血清就會(huì)受影響。轉(zhuǎn)染后在6小時(shí)左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用大，其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡。轉(zhuǎn)染時(shí)不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時(shí)加入。加入過早會(huì)引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，過晚會(huì)引起較多細(xì)胞死亡。可實(shí)時(shí)觀察1/5細(xì)胞變圓的時(shí)候加入血清。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少。青島細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑報(bào)價(jià)

當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法：1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。常用細(xì)胞類型：cos-7、BHK、NIH3T3、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無(wú)法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70%的細(xì)胞?，F(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，可以較大的降低細(xì)胞的死亡率，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

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