盡管現(xiàn)有的RNA提取試劑都用壓制RNase的成分,但提取的材料仍需謹(jǐn)慎處理。提取的材料的新鮮度是獲取完整RNA的關(guān)鍵,但是由于種種原因無法立即從新鮮材料中提取RNA時(shí),使用Takara公司的樣品保護(hù)劑SampleProtectorforRNA/DNA可以免去使用液氮或超低溫冰箱的不便,同時(shí)也可以有效解決組織、細(xì)胞樣品的短時(shí)間保存及運(yùn)輸問題。此外,如果將不同時(shí)期收集的樣品都預(yù)先存放于本試劑中,可以做到立即終止并固定RNA表達(dá)的時(shí)序變化,減少實(shí)驗(yàn)組間的誤差,RNA提取試劑的選擇:首先,要確定材料的可用性。RNA提取試劑注意事項(xiàng):盡量不要對著RNA樣品說話,以防RNA酶污染。昆明正規(guī)RNA提取試劑廠家批發(fā)價(jià)
RNA充當(dāng)遺傳物質(zhì):其實(shí)RNA并不是只能干這些臟活累活,實(shí)際上,它也是可以充當(dāng)遺傳物質(zhì)的。病菌的遺傳物質(zhì)大多都是RNA,比如,這次的病菌的遺傳物質(zhì)就是RNA。不過,如今具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物,它們的遺傳物質(zhì)基本上都是DNA。而科學(xué)家認(rèn)為,其實(shí)較早的生物,其實(shí)都是以RNA作為遺傳物質(zhì)的。這個(gè)假說也被叫做RNA世界假說。其實(shí)這個(gè)也很好理解,我們都知道RNA和DNA都有堿基,而且就是利用的堿基互補(bǔ)原則來完成任務(wù)的。DNA要完成生命活動(dòng)就指導(dǎo)RNA。因此,只要RNA能夠完成類似于DNA的自我復(fù)制,那么就可以作為遺傳物質(zhì)。深圳正規(guī)RNA提取試劑廠家批發(fā)價(jià)口罩愛帶不帶,做實(shí)驗(yàn)時(shí)高冷一點(diǎn),不要指點(diǎn)江山,唾沫橫飛即可。
眾所周知,RNA提取是一項(xiàng)困難的工作。常見的挑戰(zhàn)包括RNA降解、低產(chǎn)率和/或純度以及DNA污染。此外,不同的樣品類型有自己獨(dú)特的特性,需要特別注意。例如,微生物(如革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌、菌類、古生菌等)的細(xì)胞壁堅(jiān)硬,不易被化學(xué)和酶解。其他樣本類型,如糞便和植物含有壓制劑(如多酚類、腐殖酸/黃腐酸、單寧酸等),可與RNA共沉淀,并可壓制下游分析,如RT-qPCR。RNA是不穩(wěn)定的,極易降解。許多樣品含有高水平的RNase,會(huì)快速降解RNA。為了使之較小化,較好在采集時(shí)穩(wěn)定樣本中的RNA。常用的樣品穩(wěn)定方法包括液氮快速冷凍、干冰乙醇浴或-80°C冷凍室。然而,這些方法也有缺點(diǎn),如核酸的凍融損傷,并不是所有的研究人員在采集樣品時(shí)都能立即使用這些方法。
核糖核酸RNA是以DNA的一條鏈為模板,以堿基互補(bǔ)配對原則,轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈,主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá),是遺傳信息傳遞過程中的橋梁。tRNA的功能是攜帶符合要求的氨基酸,以mRNA為模板,合成蛋白質(zhì)。核糖核酸由至少幾十個(gè)核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。RNA普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物及某些病菌和噬菌體內(nèi)。RNA和蛋白質(zhì)生物合成有密切的關(guān)系。RNA是以DNA的一條鏈為模板,以堿基互補(bǔ)配對原則,轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈,主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá),是遺傳信息向表型轉(zhuǎn)化過程中的橋梁。在此過程中,轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(TransferRNA,tRNA)是攜帶與三聯(lián)體密碼子對應(yīng)的氨基酸殘基與正在進(jìn)行翻譯的mRNA結(jié)合,而后核糖體RNA(RibosomalRNA,rRNA)將各個(gè)氨基酸殘基通過肽鍵連接成肽鏈進(jìn)而構(gòu)成蛋白質(zhì)分子。rRNA是組成核糖體的部分,而核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。
動(dòng)物細(xì)胞RNA提取:1、懸浮細(xì)胞:可直接離心后棄掉培養(yǎng)基,用無菌PBS清洗1~2遍后,再用適量PBS懸浮起來,然后再加入裂解液進(jìn)行裂解。千萬不要完全棄掉液體后,往沉淀細(xì)胞里直接加入裂解液,這樣會(huì)使外表層的細(xì)胞裂解后釋放的組蛋白包裹粘附在沉淀細(xì)胞外側(cè),從而限制沉淀內(nèi)部的細(xì)胞與裂解液的接觸,從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解不徹底,降低RNA得率。2、半貼壁或貼壁不緊的細(xì)胞:棄掉培養(yǎng)基后,用PBS洗1~2次,然后直接吸取適量PBS用吸管或者泵吹打培養(yǎng)皿,把細(xì)胞吹下來,轉(zhuǎn)移到無RNA酶的EP管中,加裂解液進(jìn)行提取。3、貼壁細(xì)胞:需要先用胰酶消化,然后收集到無RNA酶的EP管中,離心去其上清,用PBS洗1~2次,去除多余的胰酶,以適量PBS重懸后繼續(xù)進(jìn)行提取步驟。在提取時(shí),實(shí)驗(yàn)人員需要佩戴口罩和手套等各種防護(hù)裝備,以防實(shí)驗(yàn)室污染。合肥RNA提取試劑生產(chǎn)廠家
RNA 提取關(guān)鍵點(diǎn)病菌 RNA 在提取后也仍然具有傳染性。昆明正規(guī)RNA提取試劑廠家批發(fā)價(jià)
RNA提取真正需要注意的要點(diǎn):你的植物組織樣本采樣、保存正常嗎?組織裂解充分了嗎?組織起始量是否過大?起始量過大的話,他們得帶進(jìn)去多少RNase呀,導(dǎo)致裂解液不能充分壓制內(nèi)源性的RNase,失敗就在預(yù)料之中!你的細(xì)胞活性好嗎?細(xì)胞都到衰亡期了,你提什么RNA呀;細(xì)胞加的那么多,破壁不充分,怎么裂解的好呢,他們本身得帶進(jìn)去多少內(nèi)源性RNase污染呀!轉(zhuǎn)移液體時(shí)吸到沉淀了嗎?吸水相時(shí)碰到中間層了嗎?乙醇干燥凈了嗎?裂解樣本的過程是重中之重液氮研磨(手工):要先加液氮預(yù)冷一下研缽,然后研磨,研磨過程要保證研缽中一直有少量液氮,研磨完成一個(gè)樣本后,直接加入裂解液渦旋震蕩后放常溫,或者直接丟到液氮中,全部研磨后一起加裂解液。液氮研磨(研磨儀):研磨模塊丟到液氮中預(yù)冷,直到?jīng)]有氣泡冒出視為預(yù)冷完畢。在2ml圓底離心管(不需要無酶管,液氮研磨中不破裂就好)中加入5mm鋼珠一粒,放進(jìn)樣品,投入液氮中預(yù)冷。把所有預(yù)冷好的離心管**研磨模塊中,放進(jìn)研磨機(jī)震蕩20-30秒。完成后馬上加裂解液,渦旋。RNA提取試劑銷售廠家總共可以使用該試劑盒進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)提取。昆明正規(guī)RNA提取試劑廠家批發(fā)價(jià)
總RNA提取試劑試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7kb和15kb之間不連續(xù)的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分),兩條優(yōu)勢核糖體~5kb(28S)和~2kb(18S),低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間(tRNA,5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值≥1.8。注意如果是普通瓊脂糖凝膠電泳,28S的位置大約在2kb,18S大約在1kb的位置,不同濃度的凝膠位置變化較大。注意事項(xiàng):樣品用總RNA提取試劑勻漿后,如果不即刻加入氯仿之前,置于-70°C下可放置一個(gè)月以上。保存在7...