鼠尾膠原在心肌細胞氧化損傷中的保護作用:原蛋白具有抗氧化作用,但既往在實驗室主要將鼠尾膠原用于促進細胞貼壁和支架構(gòu)建,對于其抗氧化作用目前尚無相關(guān)研究。目的:探討鼠尾膠原對過氧化氫導(dǎo)致離體心肌細胞氧化損傷的保護作用。方法:將原代培養(yǎng)的SD大鼠乳鼠心肌細胞隨機接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿(實驗組)和普通培養(yǎng)皿(對照組)中,并且均用0,10,100μmol/LH2O2誘導(dǎo)。24h后,以電子顯微鏡觀察各組乳鼠心肌細胞的形態(tài),應(yīng)用MTT比色法檢測心肌細胞存活率,TUNEL法檢測心肌細胞凋亡形態(tài),流式細胞技術(shù)檢測心肌細胞凋亡率,黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶活力,硫代巴比妥比色法檢測丙二醛水平,Western-Blot檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達。將無組織纖維、脂肪和多糖殘留的鼠尾腱,真空冷凍干燥備用。蕪湖鼠尾膠原產(chǎn)品介紹
鼠尾膠原:鼠尾膠原是一種天然培養(yǎng)基和一種天然的黏附劑。實驗設(shè)備及材料:大鼠尾巴、剪刀、鑷子、止血鉗、彎頭吸管、平皿、三角燒瓶、燒杯、量筒、天平、生理鹽水、75%酒精、0.1%醋酸溶液、蓋玻片、培養(yǎng)瓶、鉆石筆、鼠尾膠原。實驗內(nèi)容:1、制備鼠尾膠原(兩個同學(xué)一組操作)。2、切割小玻片。3、利用鼠尾膠原將小玻片固定于培養(yǎng)瓶內(nèi)。制備鼠尾膠原:1、取大鼠尾巴洗凈,75%酒精浸泡5分鐘;2、手持尾巴,用止血鉗夾住鼠尾的,折斷尾骨后拉出尾腱;3、將尾腱剪斷置于平皿中,生理鹽水浸泡;4、重復(fù)步驟2、3,直至尾腱量夠用;5、吸去生理鹽水,將尾腱稱重(0.5-1克);6、將尾腱置于平皿內(nèi)剪碎,轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中;7、按每克尾腱50ml的比例,加入0.1%醋酸溶液;8、搖晃,使尾腱分散于醋酸溶液中,4℃放置一星期;9、離心,4000轉(zhuǎn)/分,10-15分鐘;10、吸取上清,分裝成小瓶,4℃保存。開封正規(guī)鼠尾膠原生產(chǎn)廠家鼠尾膠原是一種天然培養(yǎng)基,它具有促進體外培養(yǎng)細胞(特別是上皮細胞)貼壁的作用。
鼠尾膠原備用膠凝程序:1)在冰上放置以下物品:膠原蛋白I、無菌10×PBS、無菌蒸餾水、無菌1MNaOH。2)確定膠原蛋白I待使用溶液所需的較終濃度的體積。3)在冰上放置無菌管以收存膠原蛋白I。4)在無菌條件下執(zhí)行以下步驟。4.1加入10×PBS(終體積/10)mL4.2計算要使用的膠原蛋白I的體積(不要添加到管中直到步驟4.6為止)終體積x終膠原蛋白I濃度(mg/mL)。4.3向10×PBS溶液中加入(要加入的膠原體積×0.023)mL的無菌冰冷1MNaOH。4.4向4.3溶液中加入下述體積的無菌冰冷蒸餾水:添加蒸餾水體積=V(終)—V(膠原蛋白)—V(10×PBS)—V(1MNaOH)4.5混合管中的物質(zhì)并放入冰中。4.6加入膠原蛋白I并計算體積,混勻,冰上備用。5)膠原蛋白I溶液可立即使用或在冰上放置2-3小時。6)使用時,無菌條件下將溶液加入到細胞培養(yǎng)裝置中37°C凝膠30min。論鼠尾膠原能促進毛細胞貼壁,涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實驗的長時程記錄,并且制作簡便,成本低廉。
膠原蛋白的提取方法:酸法提取:酸法提取主要采用低離子濃度酸性條件浸漬處理原料,從而破壞分子間的鹽鍵和希夫堿,而引起纖維膨脹、溶解。作為溶劑使用的酸,主要有鹽酸或亞硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、檸檬酸和甲酸等。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法,用酸法提取的膠原較大程度地保持了其三股螺旋結(jié)構(gòu)。此法處理快速,所得產(chǎn)品的分子量是連續(xù)的,適用于醫(yī)用生物材料及原料的制備,但產(chǎn)品得率低,設(shè)備腐蝕嚴重,污染重。趙蒼碧等[2]采用0.3%的醋酸溶液在4℃下從牛腱中提取膠原蛋白,得到高純度的膠原蛋白溶液。鼠尾膠原醋酸溶解:制備成濃度為0.1%的溶液。
膠原蛋白的應(yīng)用:1.膠原天然的緊密的纖維結(jié)構(gòu),使膠原材料顯示出很強的韌性和強度,適用于薄膜材料的制備;2.大較膠原被用作制造腸衣等可食用包裝材料.其獨特之處是:在熱處理過程中.隨著水分和油脂的蒸發(fā)和熔化.膠原幾乎與肉食的收縮率一致。而其他的可食用包裝材料還沒被發(fā)現(xiàn)具有這品質(zhì);3.由于膠原分子鏈上含有大量的親水基團.所以與水結(jié)合的能力很強.這一性質(zhì)使膠原在食品中可以用作填充劑和凝膠;4.膠原在酸性和堿性介質(zhì)中膨脹,這一性質(zhì)也應(yīng)用于制備膠原基材料的處理工藝中。一種被稱作鼠尾膠原蛋白的“珍貴”液體就來自大鼠的尾巴。重慶正規(guī)鼠尾膠原單價
制備鼠尾膠原:搖晃,使尾腱分散于醋酸溶液中,4℃放置一星期。蕪湖鼠尾膠原產(chǎn)品介紹
三維膠原的制備:鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上,pH7左右時可形成具有一定強度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中,在成膠過程中需要加入0.06X體積的0.1mol/LNaOH來中和。需要的溶液(均需要無菌、預(yù)冷):10xPBS(可含10mg/L的酚紅用于pH指示)或10x培養(yǎng)液,0.1mol/LNaOH,0.1mol/L乙酸(一般不用),雙蒸水A.不含細胞的三維膠原的制備(以配制1毫升,1mg/ml三維膠為例):將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中,加入690ulH2O。然后加到12ul0.1mol/LNaOH中(如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)),立即混勻。蕪湖鼠尾膠原產(chǎn)品介紹
鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用方法及注意事項:將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10PBS,使用前需要加入適當(dāng)體積的細胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。B.含細胞的三維膠原的制備(以配制200ul鼠尾膠原蛋白(5mg/ml)加到(如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中,會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)),立即混勻。再加入23ul10PBS10培養(yǎng)液,混勻(混勻后pH左右,如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,初次使用時需要用pH試紙測試)。加入760ul的細胞懸浮液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放20分鐘待膠凝固后,加入適...