原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：轉(zhuǎn)染過(guò)程不可添加物品，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；開始實(shí)驗(yàn)siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM、30nM、50nM、100nM進(jìn)行摸索，后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果修改。RFectPM可用來(lái)轉(zhuǎn)染siRNA、antisenseRNA、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。對(duì)于大多數(shù)原代細(xì)胞，RFectPM的細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率都在80%以上，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡(jiǎn)便，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效果沒有影響，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境。徐州原代細(xì)胞分離試劑盒直銷價(jià)

細(xì)胞凍存：通常我們不推薦重新凍存原代細(xì)胞，因?yàn)檫@可以促進(jìn)細(xì)胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代?xì)胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或損傷。與細(xì)胞系不同，原代細(xì)胞增殖有限，我們建議盡早使用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以防止遺傳漂移，如果你正在使用一個(gè)增殖困難的細(xì)胞類型，你應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，因?yàn)樯倭炕祀s的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）可能隨著時(shí)間的推移，大量生長(zhǎng)從而成為主要細(xì)胞。正常的原代細(xì)胞培養(yǎng)，在無(wú)污染的情況下，建議培養(yǎng)基中不加抗體，抗體會(huì)影響細(xì)胞的某些基因變異從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有差異，所以cellsystems的細(xì)胞在分離提取時(shí)就考慮到這點(diǎn)，他們不會(huì)采用任何抗體去分離和純化的同時(shí)，通過(guò)酶消化或者離心洗滌的方法讓細(xì)胞達(dá)到95%以上的純度，這樣得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確上海正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒銷售廠家原代細(xì)胞作為更接近體內(nèi)環(huán)境的研究模型。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件：靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)：a.細(xì)胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性。b.細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細(xì)胞/L。c.培養(yǎng)基可用Eagle(MEMCorning10-010-CVR)或DMEM(Corning10-013-CVR)培養(yǎng)。d.胎牛血清濃度為10%-80%。e.應(yīng)在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。f.在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落，漂浮。g.待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應(yīng)將原代細(xì)胞換液。h.用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液。

原代細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)及作用：1.細(xì)胞壁（CellWall）【動(dòng)物細(xì)胞沒有】位于植物細(xì)胞的外層,是一層透明的薄壁。它主要是由纖維素和果膠組成的，孔隙較大，物質(zhì)分子可以自由透過(guò)。細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞起著支持和保護(hù)的作用。2.細(xì)胞膜（CellMembrane)細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)緊貼著一層極薄的膜，叫做細(xì)胞膜。這層由蛋白質(zhì)分子和磷脂雙層分子組成的薄膜，水和氧氣等小分子物質(zhì)能夠自由通過(guò)，而某些離子和大分子物質(zhì)則不能自由通過(guò)，因此，它除了起著保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部的作用以外，還具有控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的作用：既不讓有用物質(zhì)任意地滲出細(xì)胞，也不讓有害物質(zhì)輕易地進(jìn)入細(xì)胞應(yīng)該添加額外的組織特異性因子，以防止成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系細(xì)胞的來(lái)源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來(lái)源于胚胎、組織部位及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開展單細(xì)胞克隆、純化，經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過(guò)程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù)?？壳肮?jié)原代細(xì)胞的取材人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的靠前步，若取材不當(dāng)，將會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。長(zhǎng)沙正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家推薦

必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。徐州原代細(xì)胞分離試劑盒直銷價(jià)

原代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持：1.消化培養(yǎng)法2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。3.部位培養(yǎng)部位培養(yǎng)是指從供體取得部位或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，部位培養(yǎng)可保持部位組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。徐州原代細(xì)胞分離試劑盒直銷價(jià)