隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”提高。國(guó)內(nèi)雙光子顯微鏡成像視野于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率。

配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。

摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性，使雙光子碳點(diǎn)（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm的紅光發(fā)射特性。在638nm激光照射下，除了長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射外，還可以實(shí)現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了巨大的可能性。更重要的是，通過各種表征和理論模擬證實(shí)，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用。這種親和力不僅為實(shí)現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能，而且通過ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物，賦予治療過程中的熒光變異。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力、光動(dòng)力療法（PDT）過程中的熒光變化、長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)處理的智能CDs。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個(gè)光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號(hào)。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時(shí)候，開始要想方案，后來要解決各種實(shí)際問題。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，容易走彎路，多花錢，也多花時(shí)間，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買，在國(guó)內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來分享，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室對(duì)于顯微成像技術(shù)包含：寬場(chǎng)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。進(jìn)口ultima雙光子顯微鏡光子探測(cè)

成像平臺(tái)倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡

目前，腦科學(xué)的研究在全球范圍內(nèi)如火如荼，中國(guó)的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng)。其中，全景式分析腦連接圖和功能動(dòng)態(tài)圖的研究成為重點(diǎn)研究方向，如何打破尺度壁壘，將微觀神經(jīng)元和突觸的信息處理和個(gè)體行為信息與全腦融合，是該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，北京大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院電子系、工程學(xué)院和中國(guó)人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)在NatureMethods上在線發(fā)表了一篇題為《大視場(chǎng)、多平面、長(zhǎng)程腦成像的微型雙光子拷貝》的文章。本文報(bào)道了第二代小型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0。其成像視場(chǎng)是團(tuán)隊(duì)2017年發(fā)布的第1代小型化顯微鏡的7.8倍。同時(shí)具有三維成像能力，獲得了小鼠自由運(yùn)動(dòng)行為時(shí)大腦三維區(qū)域數(shù)千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一批次神經(jīng)元一個(gè)月的跟蹤記錄。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡