對(duì)于雙光子(2P)成像，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)相對(duì)較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子(3P)成像，這兩個(gè)問(wèn)題**減少。 然而，由于熒光團(tuán)的吸收截面遠(yuǎn)小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強(qiáng)度的熒光信號(hào)。 功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡要求更高，后者需要更快的掃描速度以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)。 為了在每個(gè)像素的停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)，需要更高的脈沖能量。 復(fù)雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)既有本地連接，也有遠(yuǎn)程連接。 為了將神經(jīng)元的活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái)，需要同時(shí)監(jiān)測(cè)* * *分布的超大型神經(jīng)元的活動(dòng)。 大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將在幾十毫秒內(nèi)處理輸入的刺激。 為了理解這種快速神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，MPM需要快速成像神經(jīng)元的能力。 快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。 利用多光子顯微鏡的多點(diǎn)光ji活能力，我們可以研究多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞之間的連接和控制。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡多光子激發(fā)
雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn):a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見(jiàn)光或近紅外光為激發(fā)光，對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適合長(zhǎng)期研究；b.穿透力強(qiáng):與紫外光、可見(jiàn)光或近紅外光相比，穿透力強(qiáng)，可用于生物樣品的深入研究；c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P，熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)λ左右的體積內(nèi)；d.漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白。E.高熒光收集率與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片，提高了熒光收集率。采集效率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。F.對(duì)探測(cè)光路要求低。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長(zhǎng)差越來(lái)越大，加上自發(fā)三維濾波效應(yīng)，多光子顯微鏡對(duì)光路采集系統(tǒng)的要求遠(yuǎn)低于單光子共焦顯微鏡，光學(xué)系統(tǒng)也相對(duì)簡(jiǎn)單。G.適用于多標(biāo)簽復(fù)合測(cè)量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬，從而可以用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息，便于相互比較和補(bǔ)充。美國(guó)熒光多光子顯微鏡暗場(chǎng)成像高效激發(fā)，長(zhǎng)波長(zhǎng)照射，多光子顯微鏡提升樣品存活率。
2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來(lái)，通過(guò)使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描；但是，遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差，從而無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì)，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無(wú)球差的軸向掃描。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示，由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡（GSM）和一個(gè)空氣物鏡（OBJ1），另一個(gè)臂（稱為照明臂）由一個(gè)水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對(duì)齊，以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中，GSM對(duì)其進(jìn)行掃描，進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描。
繼首代小型化雙光子顯微鏡在國(guó)際上獲得小鼠自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和突觸的動(dòng)態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩(wěn)定地對(duì)自由活動(dòng)小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一批神經(jīng)元的一個(gè)月追蹤記錄。通過(guò)對(duì)微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)系統(tǒng)的。微物鏡工作距離延長(zhǎng)至1mm，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該掃描模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時(shí)拔插，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時(shí)，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米。多光子顯微鏡-適用于各行各業(yè)的觀察需求。
因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。多光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的生物組織觀測(cè)。高速高分辨率多光子顯微鏡方案
精確觀測(cè)生物分子相互作用，多光子顯微鏡推動(dòng)生命科學(xué)研究發(fā)展。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡多光子激發(fā)
多光子激光掃描顯微鏡的產(chǎn)業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要分布在德國(guó)和日本，德國(guó)以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎(chǔ)，日本以尼康和奧林巴斯為基礎(chǔ)。2020年以來(lái)，這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的64.44%，它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前，世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長(zhǎng)，中國(guó)市場(chǎng)的需求增長(zhǎng)更快。未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。美?guó)共聚焦多光子顯微鏡多光子激發(fā)
