單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長。滔博生物多光子顯微鏡廣應(yīng)用于生命科學、生物醫(yī)學和材料科學領(lǐng)域!美國飛秒激光多光子顯微鏡方案

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像。bruker多光子顯微鏡實驗高精度、低損傷、高速掃描，多光子顯微鏡為科研工作提供強大支持。

對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導、誘導分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常必要的。利用多光子顯微鏡的光遺傳學操作能力，我們可以對某類神經(jīng)元的ji活和失活進行高精度的操作。

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進行觀測，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細胞內(nèi)用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù)，利用多光子激發(fā)熒光的原理來觀察生物樣品的細胞結(jié)構(gòu)和功能。bruker多光子顯微鏡實驗

雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。美國飛秒激光多光子顯微鏡方案

要想實現(xiàn)離散的軸向重新聚焦，需要在OBJ1的焦平面中放置一個階梯鏡（圖3b）。當入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑。并且返回的激光束會被GSM消除橫向掃描，即OBJ2形成的焦點不會進行橫向掃描，實現(xiàn)軸向掃描。如果激光點被掃描到與焦平面不一致的階梯，則會形成遠離鏡面的激光焦點，返回的激光束會在無窮大的空間中會聚或發(fā)散，進而導致由OBJ2形成的激光焦點也在軸向重新聚焦，通過這種方式即能實現(xiàn)離散的軸向掃描。對于已精確匹配兩個物鏡光瞳的光學裝置，不會引入像差。為了進行連續(xù)的軸向重新聚焦，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡，同時入射的激光焦點也需要被傾斜，使得其以垂直于鏡面的方向入射，通過相對入射激光束稍微平移OBJ1即可實現(xiàn)這種傾斜。美國飛秒激光多光子顯微鏡方案