現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在細(xì)胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動(dòng)態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要。多光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的顯微鏡技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿?。嚙齒類多光子顯微鏡多光子激發(fā)
與傳統(tǒng)的單光子寬場(chǎng)熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能，極大地促進(jìn)了研究人員對(duì)整個(gè)大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像、大數(shù)量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像三個(gè)方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù)。為了將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發(fā)光和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強(qiáng)度可以解決散射問題，但會(huì)帶來其他問題，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外，對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。嚙齒類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)多光子顯微鏡，突破生物組織成像深度，洞察細(xì)胞間的奧秘。
當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上，此時(shí)被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個(gè)激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會(huì)形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn)，這又導(dǎo)致返回的光束會(huì)聚或發(fā)散，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對(duì)于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，從而可以在三個(gè)維度上量化快速的囊泡動(dòng)力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦，該技術(shù)可對(duì)大腦組織和斑馬魚心臟動(dòng)力學(xué)進(jìn)行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。
2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來，通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對(duì)焦時(shí)對(duì)反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度，ETL會(huì)引入球差和高階像差，無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì)，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì)。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成，另一個(gè)臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成。兩個(gè)臂對(duì)齊，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描。多光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的生物組織觀測(cè)。
Ca2+是重要的第二信使，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對(duì)Ca2+熒光信號(hào)進(jìn)行觀測(cè)，可以從某些方面對(duì)有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對(duì)單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。融合先進(jìn)激光技術(shù)，多光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)高速、高清晰度成像。嚙齒類多光子顯微鏡多光子激發(fā)
光子顯微鏡是一種使用可見光或近紅外光的顯微鏡。嚙齒類多光子顯微鏡多光子激發(fā)
雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn):a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見光或近紅外光為激發(fā)光，對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適合長期研究；b.穿透力強(qiáng):與紫外光、可見光或近紅外光相比，穿透力強(qiáng)，可用于生物樣品的深入研究；c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P，熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)λ左右的體積內(nèi)；d.漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白。E.高熒光收集率與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片，提高了熒光收集率。采集效率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。F.對(duì)探測(cè)光路要求低。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長差越來越大，加上自發(fā)三維濾波效應(yīng)，多光子顯微鏡對(duì)光路采集系統(tǒng)的要求遠(yuǎn)低于單光子共焦顯微鏡，光學(xué)系統(tǒng)也相對(duì)簡單。G.適用于多標(biāo)簽復(fù)合測(cè)量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬，從而可以用單一波長的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息，便于相互比較和補(bǔ)充。嚙齒類多光子顯微鏡多光子激發(fā)
