其實電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或意義不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來說，觀察時，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大很大程度，也可能看到兩個相交的亮點(艾里斑)，沒有明顯的邊界(更不用說細(xì)節(jié)了)，說明分辨率不夠。沒有分辨率談放大是沒有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長的一半。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限，但準(zhǔn)確的說應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實空間，即可得到真實的晶體表面像。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。激光雙光子顯微鏡作用
使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商雙光子顯微鏡角膜成像。
雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者M(jìn)ariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生的非線性過程，需要極高的電場強(qiáng)度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復(fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強(qiáng)較低，無法激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。
細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？
隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡型號有哪些？國外布魯克雙光子顯微鏡聯(lián)系方式
雙光子顯微鏡有哪些分類呢？激光雙光子顯微鏡作用
從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像的研究；激光雙光子顯微鏡作用
