與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻(xiàn)、開發(fā)、進(jìn)步和數(shù)個(gè)世紀(jì)以來多個(gè)來源和地點(diǎn)的改進(jìn)。bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢(shì)。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí)。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場(chǎng)合更廣（可測(cè)量更多的參數(shù)，請(qǐng)參見表1-1），且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)），空間分辨率可達(dá)到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測(cè)量深度方面不及PET，但在測(cè)量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢(shì)。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測(cè)量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像。熒光多光子顯微鏡系統(tǒng)雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是后基因組時(shí)代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型，這為在體內(nèi)研究基因表達(dá)、分子間相互作用、細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡和新生血管生成提供了良好的生物學(xué)條件。然而，盡管利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法對(duì)基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，但仍然無法實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在細(xì)胞的生理過程中，基因尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相互作用往往是可逆的、動(dòng)態(tài)變化的。目前，分子生物學(xué)方法無法捕捉到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲得這些信息對(duì)于研究基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的相互作用非常重要。因此，有必要發(fā)展一種動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活性的方法。

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會(huì)聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動(dòng)透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描。而可調(diào)電動(dòng)式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點(diǎn)，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代。遠(yuǎn)程對(duì)焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。1990年A.Mayer在Science上刊文展示了雙光子激光掃描熒光顯微鏡。美國(guó)bruker多光子顯微鏡層析成像

多光子顯微鏡被認(rèn)為是、完整生物組織成像的手段之一，其成像尺度從分子級(jí)別到整個(gè)有機(jī)體。bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

多光子顯微鏡對(duì)成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射小（小粒子的散射與波長(zhǎng)的四次方的成反比）。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點(diǎn)區(qū)發(fā)射出的散射光子，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層激發(fā)。多光子熒光成像的特點(diǎn)。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對(duì)厚散射物質(zhì)成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長(zhǎng)是單光子吸收的2倍以上，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測(cè)定的信噪比更高。觀察活細(xì)胞∶離子測(cè)量（i.e.Ca2+），GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白，能對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間觀察。bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

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