高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾，極大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度。雙光子顯微鏡能夠進行指標成像；美國ultima雙光子顯微鏡最大分辨率

單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細胞內(nèi)的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術(shù)能準確定位細胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細胞單個樹突棘中的鈣分布。國外激光雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。

其實電子顯微鏡相比于光學顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義，準確的來說，不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。通俗的來說，就是進行觀察的時候，除了要將物體放大，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學顯微鏡下，即使放大到很大，看到的可能卻是兩個相交的亮斑（艾里斑），而沒有明顯的界限（更不用說細節(jié)了），這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，約等于光波波長的一半，通常被說成是光學顯微鏡放大極限，其實準確地來說，應(yīng)該叫做分辨率的極限。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種，題主說的是像REM的。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實空間，得到真正的晶體表面圖像了。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。國外激光雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。美國ultima雙光子顯微鏡最大分辨率

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍寶石激光器出射后，由一個光學參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光。美國ultima雙光子顯微鏡最大分辨率

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