從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究；雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡圖像對比度這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積，并同時保持較高的時間和空間分辨率。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩個不同顏色，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng)，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面，覆蓋縱深達(dá)600微米，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達(dá)到2000個以上。

王愛民副教授結(jié)合工作實例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r、在體、原位、無創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實驗。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少

微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

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