雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后，由一個(gè)光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束。多焦點(diǎn)光束通過一個(gè)硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號(hào)。熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光。ultimainvestigator雙光子顯微鏡授權(quán)公司對(duì)于顯微成像技術(shù)包含：寬場(chǎng)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊(duì)伍。目前，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動(dòng)的中國腦科學(xué)計(jì)劃?？梢云诖?，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于，光學(xué)顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別，在于一個(gè)基本的原理，光的衍射。。。光波是一個(gè)有趣的東西，其中有一項(xiàng)，如果物體的體積小于光的波長，光一般可以繞過去，不發(fā)生明顯變化。也就是說，有這個(gè)物體和沒這個(gè)物體，在這種情況下，光是不會(huì)發(fā)生明顯改變的?？梢姽獾牟ㄩL（肉眼）：380～780納米，也就是，如果比380納米還要小的東西，用光學(xué)顯微鏡，無論你放大多少倍，也是看不見的。因?yàn)楣饫@過去了。。。光的衍射為了克服這個(gè)問題，科學(xué)家用波長更短的光去照射物體，也是就被觀測(cè)物。比如10納米級(jí)的光，這樣，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西。這就是電子顯微鏡多說一句，光速是不變的。光速=頻率×波長。波長越短，頻率越大。。頻率越大，光波的能量越大。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大，能看到的東西越小。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當(dāng)你看到的物體小于較小可見光的波長，那它就是沒有顏色的。。。因?yàn)轭伾侨庋蹖?duì)于可見光頻率在大腦中的投影。。。。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住?。。沒有顏色不是透明的意思，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點(diǎn)偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個(gè)雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對(duì)多種臟器的成像研究。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡非常適合對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行長時(shí)間在體成像。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

在深度組織中以較長時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

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