2020年，臨研所、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持。王愛(ài)民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來(lái)即時(shí)病理、離體組織檢測(cè)、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。熒光激光雙光子顯微鏡分辨率是多少雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像。

單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較短，成像深度有限；能量較大,會(huì)造成對(duì)熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對(duì)樣本損害大,很難用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像。而寬場(chǎng)顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，但寬場(chǎng)顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測(cè)。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹(shù)突甚至單個(gè)樹(shù)突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹(shù)突棘中的鈣分布。

光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡本質(zhì)的區(qū)別在于，光學(xué)顯微鏡：用的是可見(jiàn)光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別，在于一個(gè)基本的原理，光的衍射。。。光波是一個(gè)有趣的東西，其中有一項(xiàng)，如果物體的體積小于光的波長(zhǎng)，光一般可以繞過(guò)去，不發(fā)生明顯變化。也就是說(shuō)，有這個(gè)物體和沒(méi)這個(gè)物體，在這種情況下，光是不會(huì)發(fā)生明顯改變的?？梢?jiàn)光的波長(zhǎng)（肉眼）：380～780納米，也就是，如果比380納米還要小的東西，用光學(xué)顯微鏡，無(wú)論你放大多少倍，也是看不見(jiàn)的。因?yàn)楣饫@過(guò)去了。。。光的衍射為了克服這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家用波長(zhǎng)更短的光去照射物體，也是就被觀測(cè)物。比如10納米級(jí)的光，這樣，就能看到我們用肉眼無(wú)論如何都看不見(jiàn)的東西。這就是電子顯微鏡多說(shuō)一句，光速是不變的。光速=頻率×波長(zhǎng)。波長(zhǎng)越短，頻率越大。。頻率越大，光波的能量越大。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大，能看到的東西越小。顏色取決于物體能反射光的波長(zhǎng)的長(zhǎng)短當(dāng)你看到的物體小于較小可見(jiàn)光的波長(zhǎng)，那它就是沒(méi)有顏色的。。。因?yàn)轭伾侨庋蹖?duì)于可見(jiàn)光頻率在大腦中的投影。。。。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎?。。。沒(méi)有顏色不是透明的意思，它們不是肉眼可見(jiàn)顏色的定義中包含的。雙光子顯微鏡知多少。

N摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性，使雙光子碳點(diǎn)（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605 nm的紅光發(fā)射特性。在638 nm激光照射下，除了長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射外，還可以實(shí)現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了巨大的可能性。更重要的是，通過(guò)各種表征和理論模擬證實(shí)，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用。這種親和力不僅為實(shí)現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能，而且通過(guò)ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物，賦予治療過(guò)程中的熒光變異。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力、光動(dòng)力療法（PDT）過(guò)程中的熒光變化、長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)處理的智能CDs。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像；ultima2PPLUS雙光子顯微鏡原理

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺(tái)儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對(duì)于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對(duì)樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對(duì)樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過(guò)這個(gè)Z軸的層面，所以對(duì)于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒(méi)有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對(duì)于一些特殊激發(fā)波長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡原理

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