首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點掃描的效果。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進(jìn)行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進(jìn)行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗，效率非常低。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過厚時，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理

雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進(jìn)行長時間在體成像。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的原理

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司專注技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)品研發(fā)，發(fā)展規(guī)模團(tuán)隊不斷壯大。一批專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊，是實現(xiàn)企業(yè)戰(zhàn)略目標(biāo)的基礎(chǔ)，是企業(yè)持續(xù)發(fā)展的動力。公司業(yè)務(wù)范圍主要包括：nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等。公司奉行顧客至上、質(zhì)量為本的經(jīng)營宗旨，深受客戶好評。公司深耕nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo，正積蓄著更大的能量，向更廣闊的空間、更寬泛的領(lǐng)域拓展。