使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實驗。進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申請多項。進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護(hù)的激光系統(tǒng)其輸出波長為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)(如GFP、eGFP、曙紅、GCaMP、CFP、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發(fā)。它可以為熒光基團(tuán)提供相對較高的峰值功率，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光相關(guān)的光子學(xué)。此外，其獨特的設(shè)計(簡單和經(jīng)濟(jì)的光源)具有創(chuàng)新雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的潛力。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度！如果你想獲得更好的圖像亮度，那么你需要短脈沖，高功率，更重要的是，干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率、短脈沖、獨特的Clean-Pulse技術(shù)和相對較高的峰值功率，這使得在雙光子顯微鏡中實現(xiàn)****亮度而無需對樣品進(jìn)行不必要的加熱成為可能。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散補(bǔ)償(可確保樣品處的短脈沖)、內(nèi)置電源控制、直觀的操作及其堅固緊湊的設(shè)計使系統(tǒng)具有非常友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應(yīng)用的良好解決方案。例如，熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機(jī)制

通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時間內(nèi)可以成像的體積，同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩種不同的顏色，同時激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個電透鏡和一個空間光調(diào)制器。因此，可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)可以記錄2000多個神經(jīng)元。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測效率。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像的研究；雙光子顯微鏡供應(yīng)商找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司。國外激光雙光子顯微鏡成像視野

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率