雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。熒光激光雙光子顯微鏡作用

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國腦科學(xué)計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時，精細地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動。國外雙光子顯微鏡應(yīng)用成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。

宇宙，浩瀚無垠，在數(shù)百億光年可觀測的空間里閃爍著上萬億個星系。人類1400克的大腦,如同一個小小的宇宙，包含了百億級神經(jīng)元和百萬億級的神經(jīng)突觸，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘。新千年伊始，世界科技強國紛紛啟動有史以來比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開。工欲善其事，必先利其器。目前，各國腦科學(xué)計劃的一個重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的活動和個體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護的激光系統(tǒng)。其輸出波長為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的雙光子激發(fā)。能給熒光基團提供比較高的峰值功率，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光有關(guān)的生物光子學(xué)學(xué)科。而且其獨特設(shè)計（制造簡單且經(jīng)濟高效的光源）對雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度！如果您希望獲得比較好的圖像亮度，那么你就需要短脈沖，高功率，較重要的是需要干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率，較短的脈沖和獨特的Clean-Pulse技術(shù)，以及具有相對比較高的峰值功率，使得其在雙光子顯微鏡中可以實現(xiàn)****的亮度，而不會對樣品造成不必要的加熱。FemtoFiberultra920交鑰匙，完全集成的色散補償（可確保樣品處的脈沖較短），內(nèi)置的功率控制，操作直觀以及其堅固而緊湊的設(shè)計，使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應(yīng)用的較好解決方案。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機制。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；國外熒光雙光子顯微鏡價格

對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。熒光激光雙光子顯微鏡作用

要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。熒光激光雙光子顯微鏡作用