針對雙光子熒光顯微鏡的特點，從理論上分析雙光子成像特點，并搭建一套時間、空間分辨率高，能實時、動態(tài)、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應實現(xiàn)∶（1）能對不同染料的雙光子熒光進行探測;（2）用特定染料對樣品標記以后，能實現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實驗的研究，改進雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質量的前提下，簡化整個系統(tǒng)，使得實驗操作方便、安全。單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內轉換把部分能量轉移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級像在生物醫(yī)學光學成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢。而在顯微成像中，雙光子熒光顯微鏡憑其獨有的優(yōu)點，成為研究細胞結構和功能檢測的重要工具。多光子顯微鏡能提供多種對比度機制。共聚焦多光子顯微鏡單分子成像定位
使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動，但神經元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。美國在體多光子顯微鏡能量脈沖多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層（400微米）細胞的形態(tài)、生理學研究。
單束掃描技術可以高速遍歷大視場（FOV）的神經組織：使用MPM對神經元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感，易出現(xiàn)運動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。
以往我們認識的光電效應是單光子光電效應，即一個電子在極短時間內能吸收到一個光子而從金屬表面逸出。強激光的出現(xiàn)豐富了人們對于光電效應的認識，用強激光照射金屬，由于其光子密度極大，一個電子在短時間吸收多個光子成為可能，從而形成多光子電效應，這已被實驗證實。為什么一般討論的光電效應都是指單光子光電效應呢？這是因為，在使用普通光源的情況下，電子吸收兩個以上光子能量的概率是非常非常小的，幾乎為零。事實上，愛因斯坦本人就考慮過在強光下發(fā)生光電效應的可能性問題。對此，他有如下的論述：光電效應中的一個電子吸收兩個光子的幾率不會大于下雨天兩個雨滴同事打在一個螞蟻上的幾率。因此，多光子光電效應在實驗上的研究成為可能，是二十世紀六十年代激光乃至強激光出現(xiàn)以后的事情。有了激光，對于雙光子光電效應，在實驗上和理論上均取得了許多成果。利用強激光，人們不僅觀察到雙光子和三光子的光電效應，甚至觀察到金靶材吸收幾十個等效光子實驗現(xiàn)象。4tune光譜檢測器，實現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測。
通過添加FACED模塊，可以將基于標準振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計算處理，在稀疏或密集的標記樣本中均可以使用，并且不受串擾的影響，而且對整個圖像平面采樣后可以進行運動校正。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象，此外，子脈沖延遲到達相同的樣品位置，能為熒光團提供充足的時間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài)，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變，以及來自細胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡，在小鼠大腦中實現(xiàn)了千赫茲速率的神經活動成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測量了清醒小鼠中V1神經元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動。多光子顯微鏡作為一種研究微觀結構和功能的技術，在眾多領域得到了普遍的應用。美國高速高分辨率多光子顯微鏡單分子成像定位
從產品類型及技術方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。共聚焦多光子顯微鏡單分子成像定位
使用MPM對神經元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描可以通過聲光偏轉器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感，易出現(xiàn)運動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。共聚焦多光子顯微鏡單分子成像定位
