與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。生產(chǎn)和消費(fèi)的角度分析多光子顯微鏡的主要生產(chǎn)地區(qū)、主要消費(fèi)地區(qū)以及主要的生產(chǎn)商。美國靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)
當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增加，即使繼續(xù)刺激，Ca2+熒光信號(hào)也不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到無刺激時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號(hào)沒有變化，但當(dāng)配子融合時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，持續(xù)數(shù)分鐘。這些現(xiàn)象對(duì)于研究受精發(fā)育的早期信號(hào)以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中，如細(xì)胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很大的變化。美國模塊化多光子顯微鏡成像分辨率多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù)。
多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足。只能對(duì)熒光成像。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán)，如色素，樣品可能受到熱損傷。分辨率略有降低，雖然可以通過同時(shí)利用共焦的小孔得到改善，但是信號(hào)會(huì)有損耗。受昂貴的超快激光器限制，多光子掃描顯微鏡的成本較高。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像、胚胎發(fā)育過程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè)、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué)、多光子激發(fā)自發(fā)熒光、其它應(yīng)用。
對(duì)于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡(jiǎn)介、多光子顯微鏡產(chǎn)品型號(hào)、產(chǎn)量、產(chǎn)值及動(dòng)態(tài)等。
針對(duì)雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn)，從理論上分析雙光子成像特點(diǎn)，并搭建一套時(shí)間、空間分辨率高，能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、多參數(shù)測(cè)量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶（1）能對(duì)不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測(cè);（2）用特定染料對(duì)樣品標(biāo)記以后，能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;（3）通過實(shí)驗(yàn)的研究，改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);（4）在保證成像質(zhì)量的前提下，簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng)，使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全。單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個(gè)光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級(jí)像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢(shì)。而在顯微成像中，雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)的重要工具。從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場(chǎng)。美國靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡
多光子顯微鏡市場(chǎng)集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高，技術(shù)難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。美國靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)
與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會(huì)帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。美國靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)
