雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來(lái)看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長(zhǎng)更短的紫外線，再將可見(jiàn)光過(guò)濾掉，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過(guò)厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無(wú)法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問(wèn)題。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過(guò)探測(cè)孔時(shí)先聚焦，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過(guò)探測(cè)***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確，同時(shí)通過(guò)改變物鏡的焦距，能對(duì)不同焦平面進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無(wú)法觀測(cè)的三維圖像。顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場(chǎng)熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。美國(guó)ultimainvestigator雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例；生物領(lǐng)域：貝爾實(shí)驗(yàn)室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴(lài)于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。信息領(lǐng)域：美國(guó)科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤(pán)的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存擴(kuò)展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點(diǎn)，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存密度。雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對(duì)樣品進(jìn)行三維觀察，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價(jià)值。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術(shù)的不斷結(jié)合，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)公司雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺(tái)儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以?xún)?nèi)的的樣品，對(duì)于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對(duì)樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對(duì)樣品進(jìn)行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過(guò)這個(gè)Z軸的層面，所以對(duì)于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒(méi)有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對(duì)于一些特殊激發(fā)波長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，效率非常低。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào)，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng)；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡廠家電話

雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被發(fā)動(dòng)，所以雙光子成像更清晰。美國(guó)ultimainvestigator雙光子顯微鏡原理

高光子密度帶來(lái)的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬(wàn)億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例生物領(lǐng)域：貝爾實(shí)驗(yàn)室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴(lài)于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。信息領(lǐng)域：美國(guó)科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤(pán)的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存擴(kuò)展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點(diǎn)，避免了層與層之間的互相干擾，極大地提高了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存密度。美國(guó)ultimainvestigator雙光子顯微鏡原理