隨著技術的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；國內ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用
雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，可以在保持細胞活性的情況下，對深層組織進行高分辨率成像。它主要用于生物學、醫(yī)學和材料科學等領域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術是基于雙光子激發(fā)的熒光成像。當激光通過樣品時，它會吸收特定波長的光子，然后發(fā)出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個連續(xù)的光子同時激發(fā)樣品，這樣可以在保持樣品完整性的同時，獲得高質量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：1.高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，它可以獲得比傳統顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統的光學顯微鏡無法對深層組織進行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個問題，因為它可以激發(fā)樣品的深層熒光。3.活細胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結合多種技術，如光譜成像、鈣離子成像和神經活動成像等，以提供更豐富的生物樣品信息?？傊?，雙光子顯微鏡是一種強大的研究工具，可以對深層組織和活細胞進行無損成像。這使得它在生物學、醫(yī)學和材料科學等領域的研究中具有廣泛的應用。ultima雙光子顯微鏡光子探測這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。
雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。
在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制。同時，她們用數字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調制其中一半子區(qū)域的入射光強度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內的成像質量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學問題提供了可行性方案。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！
在傳統寬場顯微鏡中，來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光，分辨率有了本質上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力，可以進行三維成像、動態(tài)成像等。然而，針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度，需要加大激發(fā)光功率，這又會導致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學散射，其具體優(yōu)勢如下所述。雙光子顯微鏡角膜成像。進口布魯克雙光子顯微鏡作用
雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。國內ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用
后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學系統對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預期細胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。國內ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用
